CRISPR/Cas9构建TGFBI稳定敲除HSC-3细胞系

• 作者: 何园 史聪 李玉婷 汪丙杰 郑赛巍 马聪聪
• 来源期刊: 同济大学学报（医学版）
• 学科: 医学
• 关键词: CRISPR/Cas9 TGFBI HSC-3细胞 基因敲除
• 年，卷（期）: 2018,（2）
• 所属期刊栏目: 基础研究
• 页码范围: 26-31
• 页数: 6页
• 分类号: R739.85
• 字数: 4178字
• 语种: 中文
• DOI: 10.16118/j.1008-0392.2018.02.006

摘要

目的 利用CRISPR/Cas9技术稳定敲除人口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)细胞系HSC-3中的TGFBI基因.方法 根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计能特异性针对于TGFBI外显子3上下游的小向导RNA(small guide RNA, sgRNA),并以PX330质粒为骨架构建能表达此sgRNA的真核重组质粒.将此质粒以及PGK-puro质粒共转染HSC-3细胞,用嘌呤霉素抗性筛选细胞克隆,并用PCR、核酸电泳和测序初步确定基因敲除情况,再通过实时荧光定量PCR及免疫印迹法确认细胞中TGFBI的mRNA和蛋白水平的表达变化情况.结果 通过CRISPR/Cas9技术,HSC-3中的TGFBI基因外显子3的核苷酸序列已被完全敲除.免疫印迹法检测显示,相对于HSC-3,TGFBI敲除细胞中无法检测到TGFBI蛋白的表达.同时,通过RT-qPCR对部分基因进行检测,发现一系列与细胞周期和上皮间充质转化相关基因表达发生了改变(P<0.05).结论 通过CRISPR/Cas9技术成功获得了TGFBI基因敲除的HSC-3细胞系,为进一步研究TGFBI在OSCC中的作用及其机制提供了理论基础.