基于CRISPR/cas9文库筛选的慢病毒库包装方法研究

• 作者: 刘洋 刘铁柱 张全福 曲园园 李乃哲 李川 李德新 李阿茜 梁米芳 王世文
• 来源期刊: 中华实验和临床病毒学杂志
• 关键词: CRISPR/cas9文库筛选 慢病毒库包装 高通量测序技术
• 年，卷（期）: 2019,（2）
• 所属期刊栏目: 技术方法
• 页码范围: 207-211
• 页数: 5页
• 字数: 3291字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2019.02.020

摘要

目的 探讨基于CRISPR/cas9 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences/CRISPR-associated protein 9)文库筛选的慢病毒库包装优化条件.方法 采用RT-PCR、酶联免疫吸附试验(ELISA法)和免疫荧光法,对不同质粒配比、不同收毒时间以及不同量的Lipofectamine 3000 reagent包装出的慢病毒滴度进行检测,最后通过高通量测序技术评价慢病毒库的sgRNA(single guide RNA,单链引导RNA)覆盖度和reads数分布.结果 当质粒配比psPAX2∶pMD2.0G∶Lentivirus library=2∶1∶1时,慢病毒滴度较高;当加入Lipofectamine 3000 reagent的量为10μl时,慢病毒滴度较高.两种情况,RT-PCR和ELISA法结果一致.免疫荧光显示,收毒时间为60 h时慢病毒滴度较高.经Ion Torrent高通量测序,按照本研究的最优条件包装出的慢病毒库覆盖度达99.3％,sgRNA的reads数符合正态分布.结论 本研究探索了慢病毒库包装的优化条件,为下一步CRISPR/cas9文库筛选提供保证.