基于Crispr/Cas9技术构建真核细胞激酶敲除文库质粒

• 作者: 全静雯 孙朝晖 廖扬 张卫云 张蓉 李林海 杭建峰 肖斌 陈丽丹 陈建芸
• 来源期刊: 实用医学杂志
• 关键词: 基因敲除 CRISPR/Cas9文库 激酶 高通量
• 年，卷（期）: 2017,（24）
• 所属期刊栏目: 基础研究
• 页码范围: 4038-4042
• 页数: 5页
• 字数: 3687字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1006-5725.2017.24.005

摘要

目的 拟靶向细胞内一群重要的信号转导因子—激酶,利用CRISPR/Cas9技术构建真核细胞敲除文库质粒,并探讨其构建方案.方法 拟靶向编码人源激酶蛋白的507个基因开放阅读框,针对每个基因片段设计10个作用靶点,通过芯片法合成引物库(oligo pools)后,将引物从芯片上洗脱下来;合成的引物模板序列经PCR扩增、割胶回收后,与Cas9慢病毒载体连接,电转化至感受态细胞并提取质粒;质粒转化至Stbl3感受态细胞后,随机挑取单克隆进行摇菌,并送测序.结果(1)对选取的507个激酶基因进行GO分析,发现细胞激酶广泛参与各种重要的细胞信号通路;(2)以oligo pool为模板,利用合成的通用引物进行PCR扩增,得到大小约为140 bp的条带,符合预期;(3)在鉴定的40个文库质粒克隆中,共有34个克隆样品测序成功,其中25个样品与设计的目标序列完全一致,9个样品存在一定引物合成突变.部分克隆存在摇菌失败、测序无信号或双峰等因素.结论 构建好的CRISPR/Cas9激酶敲除文库可广泛用于筛选介导细胞增殖、转移、耐药、自噬等表型的重要激酶,为阐明激酶在疾病发生发展中的作用奠定基础.