构建基于CRISPR/Cas9技术敲除ALOX5的质粒

• 作者: 左荣霞 张娟娟 撒亚莲 李瑞玮 梅芬 沈涛 邹云莲
• 来源期刊: 生物技术通报
• 关键词: ALOX5 CRISPR/Cas9 基因敲除 构建 质粒
• 年，卷（期）: 2020,（3）
• 所属期刊栏目: 基因编辑专题
• 页码范围: 110-114
• 页数: 5页
• 语种: 中文
• DOI: 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0270

摘要

旨在利用CRISPR/Cas9技术构建敲除花生四烯5-脂氧合酶基因(Arachidonate 5-lipoxygenase gene,ALOX5)的重组质粒.设计合成3对靶向敲除ALOX5第六外显子的sgRNA,将其分别插入到CRISPR/Cas9质粒骨架pX458载体中,转化感受态大肠杆菌DH5α后挑取克隆,通过测序评估重组质粒是否构建成功.将构建好的重组质粒转染293T细胞,在荧光显微镜下观察转染效果,挑取转染成功的细胞,用试剂盒提取转染细胞基因组DNA,PCR扩增含敲除位点的DNA片段,用测序技术获得核苷酸序列,用DNAStar软件分析转染细胞中ALOX5基因敲除情况.测序结果表明2对双链sgRNA寡核苷酸已插入质粒,且序列正确,靶向ALOX5基因的重组质粒pX458-sgRNAs-ALOX5构建成功.其在293T细胞中的转染效率约为50％,用一代测序法未检测到sgRNAs的切割效果.初步表明利用CRISPR/Cas9技术成功构建靶向ALOX5基因的重组质粒pX458-sgRNAs-ALOX5.