古尔图病毒重组截短糖蛋白基因的表达及抗体的制备

• 作者: 刘希佳 孙素荣 张敬媛 张渝疆 李轶杰 沈姝 邓菲 阿依排日·阿布拉
• 来源期刊: 中华微生物学和免疫学杂志
• 关键词: 古尔图病毒 糖蛋白 原核表达 真核表达 兔多克隆抗体
• 年，卷（期）: 2020,（3）
• 所属期刊栏目: 病毒学
• 页码范围: 178-184
• 页数: 7页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3760/cma.j.cn112309-20191114-00376

摘要

目的 原核表达古尔图病毒(Guertu virus,GTV)糖蛋白截短片段(Gn、Gn1、Gn2、Gn3、Gc1和Gc2),分别纯化Gn-His、Gc1-His和Gc2-His重组蛋白并制备其多克隆抗体.方法 采用RT-PCR的方法分别扩增得到GTV DXM毒株截短糖蛋白Gn、Gn1、Gn2、Gn3、Gc1和Gc2基因片段,并将其构建到原核表达载体pET-32a(+)中,继而转化到E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达,SDS-PAGE分析蛋白质大小.经镍柱亲和层析纯化Gn-His、Gc1-His和Gc2-His重组蛋白,用GTV阳性羊血清通过Western blot法检测重组蛋白的抗原性.用纯化的蛋白质分别免疫新西兰白兔制备抗血清,ELISA法检测血清效价.将构建的真核表达载体pcDNA3.1-Gn和pcDNA3.1-Gc1/Gc2转染至哺乳动物Vero细胞,并用间接免疫荧光法评估前述制备的兔多克隆抗体的结合活性.最后用Western blot法检测血清与重组蛋白的特异性反应能力.结果 双酶切鉴定和测序结果表明pET-32a-Gn、pET-32a-Gn1/Gn2/Gn3、pET-32a-Gc1/Gc2、pcDNA3.1-Gn和pcDNA3.1-Gc1/Gc2重组表达载体构建正确,重组表达蛋白Gn-His、Gn1/Gn2/Gn3-His、Gc1/Gc2-His相对分子质量(Mr)大小分别约为63.4×103、37.1×103、31.9×103、30.8× 103、40×103和54.4× 103.重组表达蛋白能够被GTV阳性羊血清所识别;获得的抗GTV Gn、Gc1和Gc2兔多克隆抗体效价分别为1∶409600、1∶204 800和1∶6400.间接免疫荧光检测和Western blot结果表明制备的多克隆抗体能够与真核表达产物或重组蛋白发生特异性反应.结论 重组GTV糖蛋白Gn-His、Gc1-His和Gc2-His得到了高效表达和纯化,具有较好的免疫性.制备的多克隆抗体效价高,特异性好.本研究结果为进一步开展GTV糖蛋白生物学功能及其检测方法和疫苗研究提供参考资料.