应用CRISPR/Cas9技术建立IGF-ⅡR基因定点整合的SKBR3细胞系

• 作者: 曹中伟 王潇 马新宇
• 来源期刊: 生物技术通讯
• 学科: 生物学
• 关键词: 胰岛素样生长因子受体2 HER-2阳性乳腺癌 CRISPR/Cas9技术 基因敲入 AAVS1
• 年，卷（期）: 2020,（3）
• 所属期刊栏目: 研究报告
• 页码范围: 297-304
• 页数: 8页
• 分类号: Q78
• 字数: 4754字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1009-0002.2020.03.008

摘要

目的:采用CRISPR/Cas9系统建立胰岛素样生长因子受体2(IGF-ⅡR)基因定点整合的SKBR3细胞系,为探究IGF-ⅡR对人表皮生长因子受体2(HER-2)阳性乳腺癌细胞曲妥珠单抗耐药性的影响机制提供细胞模型.方法:根据AAVS1基因序列设计并合成6对小向导RNA(sgRNA),用UCA CRISPR/Cas9快速构建及活性检测试剂盒分别与pCS载体连接,筛选效率最高的sgRNA构建Cas9/sgRNA表达载体;用AsiSⅠ+Bstz17Ⅰ酶切将IGF-ⅡR片段连入hAAVS1-KI载体,构建IGF-ⅡR打靶载体,EcoRⅠ+ScaⅠ、NcoⅠ、BglⅡ酶切鉴定并测序验证;将Cas9/sgRNA载体和IGF-ⅡR打靶载体电转SKBR3细胞,经嘌呤霉素筛选,PCR鉴定,获得IGF-ⅡR基因定点整合的混合克隆细胞系;采用半固体及有限稀释方式制备单克隆.结果:构建了作用于AAVS1位点靶序列的Cas9/sgRNA载体,sgRNA活性检测显示sgRNA2具有最高效率;构建了作用于AAVS1位点靶序列的Cas9/sgRNA载体,sgRNA活性检测显示sgRNA2较sgRNA1、sgRNA3-6优势显著,具有最高效率;酶切鉴定并测序确认IGF-ⅡR打靶载体构建成功;电转染最佳条件为1200 V、20 ms、2个脉冲;嘌呤霉素最佳筛选浓度为0.5μg/mL;IGF-ⅡR打靶载体及pCS-sgRNA2质粒成功转染HER-2阳性乳腺癌细胞SKBR3,PCR鉴定及测序验证混合克隆片段基因型正确.结论:获得IGF-ⅡR基因在AAVS1位点定点整合的混合克隆细胞系,为进一步探究IGF-ⅡR对HER-2阳性乳腺癌细胞曲妥珠单抗耐药性影响的机制奠定了基础.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	王潇	内蒙古自治区人民医院科研处	6	2	1.0	1.0
2	曹中伟	内蒙古自治区人民医院甲乳疝外科	14	26	3.0	5.0
3	马新宇	内蒙古自治区人民医院甲乳疝外科	4	2	1.0	1.0