NLS-GFP融合基因植物表达载体的构建与应用

• 作者: 刘晶 李灿辉 栾宏瑛 王洪洋 王荟洁 陈爱娥
• 来源期刊: 农业生物技术学报
• 学科: 农学
• 关键词: 核定位信号 融合基因 植物表达载体 亚细胞定位 效应蛋白
• 年，卷（期）: 2020,（7）
• 所属期刊栏目: 研究论文与报告
• 页码范围: 1240-1249
• 页数: 10页
• 分类号: S-3
• 字数: 6493字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2020.07.010

摘要

植物细胞高度分隔成不同的膜亚细胞结构,在不同的地点适当地装配相关的蛋白来执行特定的细胞反应.细胞核是细胞的控制中心,以高度协调的方式进行蛋白质表达和运输.细胞核定位信号(nuclear localization signal,NLS)能够促进蛋白定位于细胞核中,对研究蛋白的细胞生物学功能有重要作用.基于目前NLS植物表达载体存在局限性,本研究用无缝克隆技术,将NLS与绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein gene,GFP)融合,插入植物双元表达载体pRI101-AN中,获得一个新的pRI101-NLS-GFP植物表达载体.利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导瞬时表达体系在本氏烟(Nicotiana benthamiana)中表达pRI101-NLS-GFP,以未融合NLS的pRI101-GFP为对照,荧光观察表明NLS-GFP融合蛋白主要聚集在细胞核,而pRI101-GFP荧光遍布整个细胞.同时利用马铃薯晚疫病致病疫霉菌(Phytophthora infestans)分泌的精氨酸-某氨基酸-亮氨酸-精氨酸(arginine-x-leucine-arginine,RXLR)效应蛋白PITG_04314(PITG:Phytophthora infestans T30-4 gene,GenBank No.XM_002905913)进一步研究该载体是否将融合蛋白成功导入细胞核中.前期研究证明PITG_04314定位于细胞核,伴有细胞质的背景,而细胞核是其毒性功能的主要场所.为进一步证实PITG_04314的细胞定位,通过无缝克隆技术将PITG_04314融合到pRI101-NLS-GFP和pRI101-GFP中.发现与前期研究结果一致,GFP-PITG_04314定位于细胞核,伴有细胞质的背景,而NLS-GFP-PITG_04314聚集于细胞核中.瞬时超量表达GFP-PITG_04314和NLS-GFP-PITG_04314都能促进晚疫病的侵染,表明细胞核是PITG_04314发挥毒性的场所.研究结果表明,基于无缝克隆技术的NLS-GFP融合基因植物表达载体系统可以使目标蛋白定位于细胞核中.该载体有望在病原菌蛋白细胞生物学功能研究中得到广泛应用.