应用GST pull-down技术筛选番茄SIVQ6互作蛋白

• 作者: 丁海东 原贵波 杨帆 武媛 臧栋楠 莫双榕 蒋红亮 钱莹
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 番茄 SlVQ6 SlMPK1 pull-down 互作蛋白
• 年，卷（期）: 2020,（15）
• 所属期刊栏目: 园艺
• 页码范围: 3146-3157
• 页数: 12页
• 字数: 8490字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2020.15.014

摘要

[目的]含有VQ基序(VQ)的蛋白质是植物特异性蛋白质,具有保守的"FxxhVQxhTG"氨基酸序列,调节植物生长和发育.番茄SlMPK1在高温胁迫过程中发挥重要作用,酵母双杂交(Y2H)显示SlVQ6蛋白能够与SlMPK1相互作用,通过GST pull-down技术进一步验证SlMPK1与SlVQ6的互作以及SlVQ6的互作网络,为研究SlVQ6介导的高温应答信号通路奠定基础.[方法]通过pGEX-4T-1-PC-VQ6质粒构建,以含有目的基因SIVQ6的菌液为模板,设计特异性引物,扩增目的基因序列,将获得的目的基因VQ6克隆到载体pGEX-4T-1的BamHⅠ和NotⅠ的酶切位点之间,将获得的重组质粒pGEX-4T-1-PC-VQ6转入TOP10克隆菌株经IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导表达,通过GST柱亲和纯化获得目标蛋白PC-VQ6,进而获得预期GST-SlVQ6融合蛋白,通过体外磷酸化进一步确定SlVQ6是否是SlMPK1的下游底物;以GST-SlVQ6为诱饵蛋白固定于GST Sepharose Beads上,与番茄叶片总蛋白孵育后洗脱,收集洗脱液进行SDS-PAGE凝胶电泳验证,通过LC-MS/MS检测SlVQ6可能互作的候选蛋白,并对筛选的SIVQ6互作蛋白通过GO、KEGG和蛋白互作网络进行生物信息学分析.[结果]成功构建pGEX-4T-1-PC-SlVQ6基因重组表达质粒,并获得带有GST标签的GST-SlVQ6融合蛋白,其分子量大小约为54 kD;将GST-SlVQ6和His-SlMPK1进行体外磷酸化试验,SlMPK1能够磷酸化SlVQ6,而作为阴性对照的GST与SlMPK1无相互作用,且SlVQ6不存在自磷酸化的现象,表明GST-SlVQ6和His-SlMPK1具有相互作用,且SlVQ6是SlMPK1的下游底物;以GST-SlVQ6融合蛋白为诱饵蛋白(空GST为阴性对照),利用pull-down试验筛选番茄叶片组织蛋白中与SlVQ6蛋白结合的蛋白,经SDS-PAGE分离、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)鉴定以及Mascot与蛋白数据库检索,共鉴定出37个与SlVQ6结合的蛋白,包括蛋白激酶Receptor for Activated C Kinase 1B(RACK1B),通过GO、KEGG和蛋白互作网络的生物信息学分析,表明这些蛋白参与多种信号通路,其中8个核糖体蛋白可能与高温胁迫密切相关.[结论]SlVQ6是SlMPK1的底物蛋白,且37个蛋白可能与SlVQ6互作,这些蛋白与胁迫反应有着密切的联系,可能会在提高番茄植株高温耐受性等方面发挥重要作用.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	杨帆	扬州大学生物科学与技术学院	88	586	13.0	18.0
2	武媛	扬州大学生物科学与技术学院	2	0	0.0	0.0
3	臧栋楠	扬州大学生物科学与技术学院	2	0	0.0	0.0
4	原贵波	扬州大学生物科学与技术学院	1	0	0.0	0.0
5	莫双榕	扬州大学生物科学与技术学院	1	0	0.0	0.0
6	钱莹	扬州大学生物科学与技术学院	1	0	0.0	0.0
7	蒋红亮	扬州大学生物科学与技术学院	1	0	0.0	0.0