大鼠His-Akt1重组蛋白的真核表达、蛋白纯化及活性鉴定

• 作者: 孟利 杜彩萍
• 来源期刊: 生物技术通报
• 关键词: Akt1 真核表达载体 蛋白纯化 活性鉴定
• 年，卷（期）: 2020,（12）
• 所属期刊栏目: 研究报告
• 页码范围: 98-103
• 页数: 6页
• 语种: 中文
• DOI: 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-0497

摘要

构建His-Akt1-pcDNA3.1真核表达载体,于HEK293细胞进行表达,Ni-NTA亲和纯化His-Akt1,并对Akt1进行活性鉴定.以Akt1(全长)-pcDNA3.1重组体为模板,采用PCR扩增目的基因,然后克隆入真核表达载体pcDNA3.1;将His-Akt1-pcDNA3.1转染HEK293细胞表达,Ni-NTA纯化His-Akt1,用SDS-PAGE、考马斯亮蓝染色及免疫印迹鉴定蛋白纯度;蛋白经透析后,免疫印迹检测Akt1 Ser473和Thr308磷酸化水平.His-Akt1-pcDNA3.1真核表达载体构建成功,在HEK293细胞中高效表达;考马斯亮蓝染色和免疫印迹结果显示,取2 mg过表达His-Akt1的蛋白混合液经Ni-NTA纯化后,加入含100 mmol/L咪唑的洗脱液洗脱,可获得高纯度His-Akt1重组蛋白.上述His-Akt1重组蛋白经透析后,免疫印迹结果显示His-Akt1 Ser473和Thr308磷酸化水平(活化水平)均呈高水平.重组His-Akt1-pcDNA3.1真核表达载体成功构建,且蛋白高表达,His-Akt1经提取纯化后具有较高的酶活性.