基于CRISPR/Cas9系统的多基因敲除载体的构建及其敲除效率检测

• 作者: 徐磊 赵育蓉 胡悦旻 王昊 彭玥晗 鞠辉明
• 来源期刊: 农业生物技术学报
• 学科: 农学
• 关键词: CRIPSR/Cas9 多基因敲除 载体构建
• 年，卷（期）: 2022,（5）
• 所属期刊栏目: 研究资源与技术改进|Resources and Updated Technology
• 页码范围: 1023-1030
• 页数: 8页
• 分类号: S828.8|Q812
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2022.05.019

摘要

CRISPR/Cas9系统是近年来快速发展的一种简单高效的基因编辑系统.在哺乳动物中,同时靶向敲除多基因的研究仍然较为匮乏.为优化哺乳动物中靶向多基因的敲除系统的构建,本研究在已有的CRISPR/Cas9载体的基础上进行升级改造,将4个U6启动子介导的小向导RNA(small guide RNA,sgRNA)表达框串联至一个载体中的形式制备了多基因位点编辑载体,分别选取家猪(Sus scrofa)的去乙酰化酶3基因(sirtuin 3,Sirt3)和围脂滴蛋白1基因(perilipin 1,Plin1)的2个sgRNA,构建了2个猪Sirt3 sgRNA的基因编辑载体(S2)、2个猪Plin1 sgRNA基因编辑载体(P2)和同时包括上述4个sgRNA的基因编辑载体(S2P2),上述载体分别转染猪肾细胞PK15,以转染未装载靶点质粒的细胞为对照组(CON组),在各实验组细胞目的基因的DNA水平、RNA水平和蛋白水平检测目的基因敲除效率.结果表明,各实验组细胞目的基因DNA中均检测出突变,S2P2组和S2组中Sirt3基因突变率分别为33％和26％,S2P2组和P2组中Plin1基因突变率分别为33％和24％;对目的基因RNA水平与蛋白水平的检测结果表明,与CON组相比,所有实验组的目标基因mRNA及蛋白表达量均有所下降,差异极显著(P<0.01),其中S2组与S2P2组间Sirt3基因表达量差异不显著;P2组与S2P2组间Plin1基因表达量差异不显著.本研究通过改良的CRISPR/Cas9载体系统构建了可以同时对猪Sirt3基因和Plin1基因高效编辑的载体,有助于后续开展多基因功能的研究.