关岭牛IGF1基因干扰载体构建及其对成肌细胞的影响

• 作者: 宋林锦 许厚强 李永 孙金魁
• 来源期刊: 农业生物技术学报
• 学科: 农学
• 关键词: 关岭牛 胰岛素样生长因子1(IGF1) RNA干扰 成肌细胞 细胞增殖
• 年，卷（期）: 2022,（5）
• 所属期刊栏目: 研究论文与报告|Articles and Letters
• 页码范围: 896-907
• 页数: 12页
• 分类号: S823
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2022.05.007

摘要

胰岛素样生长因子1(insulin like growth factor 1,IGF1)是通过调控骨骼肌蛋白的合成影响肌肉发育的单链多肽类激素,对细胞增殖等多种生理功能具有重要作用,本研究旨在探究IGF1基因对关岭牛(Bos taurus)成肌细胞的影响.选用健康的成年(2～3岁)关岭牛3头,采集心、肝、脾、肺、肾、前腿肌、后腿肌、背最长肌、斜方肌、臀肌、胃、小肠12个组织样提取RNA,采集背最长肌组织成功培养关岭牛成肌细胞.运用qPCR技术检测IGF1基因在不同组织中的相对表达量;运用在线软件对关岭牛IGF1蛋白质理化性质、二级结构和三级结构、亚细胞定位进行分析;同时通过在线软件设计IGF1基因的3对短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰序列和1对阴性对照序列,与pGPU6-GFP-Neo载体连接后进行测序,将构建成功的IGF1基因干扰载体转染至成肌细胞;运用qPCR技术检测并筛选出干扰效率最高的干扰载体,分析该干扰载体对IGF1基因表达的影响;运用qPCR技术检测干扰IGF1基因对细胞增殖相关基因细胞周期蛋白D1(cyclin D1)和细胞周期蛋白依赖性激酶2(cyclin-dependent kinases 2,CDK2)的相对表达量影响;运用CCK8(Cell Counting Kit-8)法检测成肌细胞增殖情况.结果表明,IGF1基因在关岭牛心、前腿肌、后腿肌、背最长肌、斜方肌、臀肌等12个组织样中均有表达,在肝中相对表达量最高,极显著高于其他组织(P<0.01);在培养关岭牛成肌细胞的基础上,成功构建关岭牛IGF1基因干扰载体,并筛选出shRNA-IGF1-1干扰效率最高(P<0.01);IGF1蛋白的分子式为C744H1186N214O216S15,相对分子质量为17.06581 kD,理论等电点为9.36,属碱性不稳定蛋白;IGF1基因被抑制后,细胞增殖相关基因cyclin D1和CDK2的表达量均极显著低于shRNA-NC(P<0.01).CCK8法检测细胞增殖结果表明,IGF1基因被抑制后,在24和72 h成肌细胞增殖均显著低于对照组(P<0.05),48 h为极显著水平(P<0.01),表明体外沉默IGF1基因后,会影响成肌细胞增殖能力和抑制成肌细胞增殖相关基因表达.本研究为进一步研究IGF1基因对关岭牛肌肉生长发育的作用及调控机制提供了基础数据.