基于酶反应动力学理论优化脂肪酶活力测定体系

• 作者: 张帆 程路峰 曹红 何德飞 郑兰兰 李春
• 来源期刊: 中国油脂
• 关键词: 脂肪酶 酶活力测定 酶反应动力学 表面活性剂
• 年，卷（期）: 2023,（5）
• 所属期刊栏目: 检测分析
• 页码范围: 155-161
• 页数: 7页
• 语种: 中文
• DOI: 10.19902/j.cnki.zgyz.1003-7969.220265

摘要

为了提高棕榈酸对硝基苯酯(p-NPP)法测定脂肪酶活力的灵敏度和准确度，以来源于Rhizopus oryzae的脂肪酶Lipase F-AP 15为研究对象，首先对其最适反应pH和反应温度进行优化，然后将表面活性剂作为激活因子引入酶活力测定体系，探究影响机制，并依据酶反应动力学理论优化测定条件(底物浓度、酶质量浓度、反应时间),对优化的p-NPP法的重复性和准确性进行了检验，最后以另一个来源的脂肪酶Lipase-PPL为模型，以同样思路与方法改进与优化其酶活力测定体系，以考察优化方法和思路的适用性。结果表明：表面活性剂PEG 8000的引入使得覆盖在脂肪酶活性位点的α-螺旋结构被重排而打开，脂肪酶由封闭构象转为并保持在活化构象，脂肪酶活性增强；优化测定体系的最适条件为pH 8.0、反应温度30℃、酶质量浓度1.00 mg/mL、底物浓度6 mmol/L、反应时间5 min,在此条件下测得的酶活力是常用p-NPP法(pH 8.0、反应温度30℃、酶质量浓度2.50 mg/mL、底物浓度10 mmol/L、反应时间8 min)测得酶活力的1.4倍；重复性和准确性试验显示，优化p-NPP法重复测定结果的相对标准偏差为1.21%,加标回收率为95.60%,均优于常用p-NPP法；优化方法和思路适用于其他来源的脂肪酶活力测定体系的优化。综上，通过将表面活性剂引入p-NPP法的脂肪酶活力测定体系，以酶反应动力学理论为指导优化测定条件，明显提高了方法的灵敏度，并有效保证了测定结果的重复性和准确性，缩短了检测时间，节省了检测成本。