贵州黑山羊COL1A1基因真核表达载体构建及其 对颗粒细胞中胶原蛋白家族基因和 产羔基因的影响

• 作者: 周明帅 温晓艳 陆情梅 刘彬 杨永鲜 赵佳福 贵州大学动物科学学院/高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室
• 来源期刊: 南方农业学报
• 关键词: 贵州黑山羊 COL1A1基因 细胞外基质 卵巢颗粒细胞 产羔性状
• 年，卷（期）: 2023,（1）
• 所属期刊栏目: 畜牧·兽医·水产·蚕桑
• 页码范围: 267-278
• 页数: 12页
• 语种: 中文

摘要

【目的】构建I型胶原蛋白α1链基因（COL1A1）过表达载体，并分析其对颗粒细胞中胶原蛋白家族基因和产羔相关基因的影响，为后续深入研究COL1A1基因影响山羊产羔性状的分子机制打下基础。【方法】通过重叠延伸PCR克隆COL1A1基因A和B片段，然后分别重组连接至pUC57和pcDNA3.1（+）线性化载体上，再通过酶切连接获得COL1A1基因全长，构建pcDNA3.1(+)-COL1A1过表达载体；转染山羊卵巢颗粒细胞后，通过Western blotting检测COL1A1蛋白表达效率，采用免疫荧光检测其在颗粒细胞中的定位情况，并以实时荧光定量PCR检测COL1A1基因过表达对胶原蛋白家族基因COL1A1、COL2A1和COL3A1及产羔相关基因[骨形态发生蛋白15(BMP15)、骨形态发生蛋白受体1B(BMPR1B)、生长分化因子9(GDF9)和促卵泡激素β亚基（FSHB）]表达的影响。【结果】COL1A1基因全长环化质粒检测大小为1847 bp，连接至pcDNA3.1（+）线性化载体上成功构建获得COL1A1基因过表达载体。Western blotting检测结果表明，pcDNA3.1(+)-COL1A1转染颗粒细胞48 h后，COL1A1蛋白表达量极显著高于pcDNA3.1（+）空载体转染组（P<0.01，下同）；免疫荧光检测结果表明，COL1A1蛋白在颗粒细胞细胞核及细胞质中均有表达，但在细胞核中的表达水平更高；实时荧光定量PCR检测结果表明，pcDNA3.1(+)-COL1A1转染组颗粒细胞中COL1A1、COL2A1和COL3A1胶原蛋白家族基因及GDF9、FSHB和BMP15产羔相关基因的相对表达量极显著高于pcDNA3.1（+）空载体转染组，但对BMPR1B基因的表达无显著影响（P>0.05）。【结论】COL1A1基因在卵巢颗粒细胞中广泛表达，其过表达能极显著促进胶原蛋白家族基因COL2A1和COL3A1及产羔相关基因GDF9、FSHB和BMPR1B在颗粒细胞中的表达，即COL1A1基因可协同胶原蛋白家族基因的表达促进ECM合成来影响卵巢组织结构、胚胎发育及促进性腺激素表达，进而影响山羊产羔性状，可作为影响贵州黑山羊多羔候选基因进行深入研究。