猪源hnRNPA1基因克隆及其真核表达载体构建

• 作者: 王文锋 高跃美 金奕欣 张丽媛 宋丹丹 罗廷荣 李晓宁 .广西大学动物科学技术学院 .广西大学/亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室 .广西壮族自治区兽用生物制品工程研究中心 .广西畜禽繁育与疾病防控重点实验室
• 来源期刊: 南方农业学报
• 学科: 农学
• 关键词: 猪;hnRNPA1基因;生物信息学分析;表达载体构建
• 年，卷（期）: 2025,（11）
• 所属期刊栏目: 畜牧·兽医·水产·蚕桑
• 页码范围: 234-243
• 页数: 10页
• 语种: 中文

摘要

【目的】克隆猪源异质性核糖核蛋白A1（hnRNPA1）基因编码区（CDS）序列并构建其真核表达载体，为探究猪源hnRNPA1蛋白结构及其生物学特性提供理论参考。【方法】利用总RNA提取试剂盒提取PK-15细胞总RNA并反转录合成cDNA，以此为模板，采用SnapeGene设计hnRNPA1基因特异性扩增引物，PCR扩增获得hnRNPA1基因CDS序列。通过ProtParam、ExPASy-ProtScale、TMHMM-1.0、SignalP-6.0、SPOMA、SWISS-MODEL和NetPhos 3.1等预测hnRNPA1蛋白的理化性质、结构及磷酸化位点。构建pcDNA3.0-hnRNPA1-Flag真核表达载体并转染HEK-293T细胞，通过实时荧光定量PCR、Western blottiing和免疫荧光染色试验检测hnRNPA1基因真核表达载体构建情况、hnRNPA1蛋白在细胞中的表达及分布情况。【结果】成功克隆猪源hnRNPA1基因CDS序列。生物信息学分析结果显示，hnRNPA1基因CDS序列全长963 bp，编码320个氨基酸残基，hnRNPA1蛋白分子量约为35 kD，理论等电点（pI）为9.27，脂肪系数为38.34，不稳定系数为43.87（大于40.00），蛋白结构相对不稳定，总平均亲水性指数（GRAVY）为-0.879，属于亲水性蛋白，不含跨膜结构域和信号肽，二级结构由α-螺旋（16.56%）、无规则卷曲（72.50%）和延伸链（10.94%）组成，存在48个潜在的磷酸化位点。Western blotting检测结果显示，真核表达载体pcDNA3.0-hnRNPA1-Flag转染HEK-293T细胞后能成功表达hnRNPA1蛋白。免疫荧光染色结果显示，hnRNPA1蛋白主要在胞质中表达。【结论】成功克隆猪源hnRNPA1基因CDS序列。猪源hnRNPA1蛋白为不稳定的亲水性蛋白，不含跨膜结构域和信号肽，二级结构主要为无规则卷曲。成功构建pcDNA3.0-hnRNPA1-Flag真核表达载体，hnRNPA1蛋白主要在胞质中表达。