应用细菌同源重组法快速构建和制备重组腺病毒

• 作者: 姜勇 李树浓 李红乐 王静珍 秦清和 邓鹏
• 来源期刊: 中国病理生理杂志
• 学科: 生物学
• 关键词: 腺病毒 同源重组 荧光蛋白
• 年，卷（期）: 2002,（11）
• 所属期刊栏目: 实验技术
• 页码范围: 1451-1454
• 页数: 4页
• 分类号: Q78
• 字数: 2749字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:1000-4718.2002.11.039

摘要

目的:利用大肠杆菌细菌同源重组构建重组腺病毒载体并在293细胞制备高滴度重组病毒.方法:自细胞周期相关激酶真核表达载体pCR3.1-CCRK中酶切出CCRK基因,亚克隆至带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达盒的腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,形成转移质粒pAdTrack-CMV-CCRK, 采用电穿孔或化学转化法在大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组,得到重组腺病毒载体pAd-CCRK.以pAd-CCRK为模板,经DNA测序正确后,用PacI酶切线性化pAd-CCRK,转染293细胞,包装成重组病毒颗粒,荧光显微镜观察转染细胞EGFP的表达,采用PCR的方法对重组腺病毒进行鉴定.将重组病毒上清感染RAW细胞,荧光显微镜下观察感染细胞重组病毒的表达.结果:成功地构建了携带CCRK基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒,重组病毒能在体外高效表达.结论:应用细菌内同源重组能够快速构建腺病毒载体,可高效制备均一的高滴度重组病毒,为CCRK基因功能的研究奠定了基础.