细菌内同源重组法构建pAd-EGFP-hSDF-1α腺病毒质粒

• 作者: 唐俊明 孔霞 杨建业 潘国栋 王家宁 郭凌郧 黄永章
• 来源期刊: 郧阳医学院学报
• 学科: 生物学
• 关键词: 同源重组, T载体 人基质细胞源衍生因子-1 腺病毒 增强型绿色荧光蛋白
• 年，卷（期）: 2006,（4）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 193-197,封二
• 页数: 6页
• 分类号: Q813.2
• 字数: 4216字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1006-9674.2006.04.001

摘要

目的:利用细菌内同源重组法构建和制备含人基质细胞源衍生因子-1α(hSDF-1α)重组腺病毒质粒. 方法:设计5' 端分别具有EcoR V/Xho Ⅰ酶切位点的扩增hSDF-1α cDNA片段上下游引物,聚合酶链反应法(PCR)从pORF-hSDF-1α质粒中扩增hSDF-1α的cDNA,插入pGEM-T Easy 载体中,构建pGEM-T-hSDF-1α质粒,EcoR V/Xho Ⅰ双酶切后回收279 bp片段,与经过相同酶切的8.8 kb pShuttle-IRES-hrGFP-2进行连接,连接产物转化感受态DH5 α,挑选克隆,重组质粒pShuttle-EGFP-hSDF-1α用EcoR V/ Xho Ⅰ酶切鉴定.pShuttle-EGFP-hSDF-1α经Pme Ⅰ酶切线性化后,转化含pAdeasy-1的超感受态BJ5183,采用细菌内同源重组法构建腺病毒质粒pAd-EGFP-hSDF-1α; pAd-EGFP-hSDF-1α质粒经PacⅠ酶切鉴定和PCR鉴定.结果:线性化的pShuttle-EGFP-hSDF-1α转化含pAdeasy-1的超感受态BJ5183, 重组质粒经酶切获得一大于23 kb的大片段和4.5 kb的片段,PCR反应扩增出了279 bp的片段.结论:用细菌内同源重组成功地构建了含hSDF-1α cDNA的重组腺病毒质粒,为进行表达hSDF-1α的重组腺病毒的制备及hSDF-1α在骨髓源干细胞动员迁移中的作用研究奠定了基础.