结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B-ESAT6的融合表达及纯化

• 作者: 师长宏 徐志凯 李元 柏银兰 范雄林 薛莹
• 来源期刊: 中华结核和呼吸杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 分枝杆菌,结核 抗原,细菌 基因融合 疫苗,DNA
• 年，卷（期）: 2004,（2）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 89-92
• 页数: 4页
• 分类号: R52
• 字数: 3421字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3760/j:issn:1001-0939.2004.02.008

摘要

目的融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B-ESAT6,为结核病的预防提供有效亚单位疫苗.方法设计含不同酶切位点的Ag85B和ESAT6引物,采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)的方法从结核分枝杆菌毒株H37Rv-DNA中分别扩增出相应大小的DNA片段,将片段分别与PGEM-T-easy载体连接测序.将测序正确的Ag85B和ESAT6按照不同的酶切位点克隆入PPRO EXHT表达载体,挑选出阳性克隆,将诱导的表达产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,同时与含6个组氨酸(histidine 6×his)的单克隆抗体(monoclonal antibody, mAb)进行固定化蛋白质免疫学测定(Western-blot),将用含Ni+鳌合剂的Ni-NTA亲合柱纯化的表达产物免疫小鼠,用结核分枝杆菌培养上清滤液蛋白(culture filtrate proteins,CFP)作为抗原,酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度.结果 PCR获得的Ag85B和ESAT6序列与基因文库(GenBank)报道的完全一致.两者在大肠杆菌DH5α株中融合表达的产物约为37 000,与预计大小相吻合.Western-blot结果显示,在相对分子量约37 000处有表达产物与6×his mAb特异性结合带.表达产物为包涵体,通过Ni-NTA纯化系统,可得到纯化的目的蛋白.Ag85B-ESAT6融合蛋白免疫小鼠血清特异性抗体滴度为1∶ 1 000,ESAT6-Ag85B融合蛋白免疫小鼠血清特异性抗体滴度为1∶ 5 000.结论结核分枝杆菌的分泌蛋白Ag85B和ESAT6被成功的融合表达,有望为结核病的预防提供有效的亚单位疫苗.