心肌α肌球蛋白重链启动子驱动的绿色荧光蛋白表达载体的构建及鉴定

• 作者: YANG Qing-Lin 唐俊明 孔霞 潘国栋 王家宁 郭凌郧 黄永章
• 来源期刊: 郧阳医学院学报
• 学科: 生物学
• 关键词: 心肌特异性 肌球蛋白重链 启动子 增强型绿色荧光蛋白 干细胞
• 年，卷（期）: 2006,（2）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 70-73,封三
• 页数: 5页
• 分类号: Q786
• 字数: 2833字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1006-9674.2006.02.002

摘要

目的:构建并鉴定心肌α肌球蛋白重链启动子驱动的绿色荧光蛋白表达载体(MHC-EGFP),该基因只在心肌中特异性表达.方法:设计5'和3'分别具有SalI/HindⅢ酶切位点的EGFP引物,聚合酶链反应法(PCR)从pLEGFP质粒中扩增增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的cDNA,插入pGEM-T Easy载体表达盒,构建pGEM-EGFP,SalI/HindⅢ双酶切后回收729 kb片断,插入经相同酶切的含5.5 kb心肌特异性α肌球蛋白重链启动子的pNC26质粒,构建pMHC-EGFP.连接产物转化感受态DH5α,挑选克隆,PCR扩增鉴定,重组质粒经NotI酶切,回收7.2 kb MHC-EGFP表达盒.分离培养小鼠心肌细胞与骨骼肌成肌细胞.MHC-EGFP表达盒通过脂质体法分别转染心肌与骨骼肌成肌细胞.荧光显微镜观察转染细胞是否出现绿色荧光,以鉴定MHC-EGFP表达盒是否具有表达特异性.结果:EGFP cDNA正确插入pNC26质粒中αMHC启动子3'端.成功转染MHC-EGFP表达盒的心肌细胞出现绿色荧光,而转染的骨骼肌成肌细胞无荧光出现.结论:MHC-EGFP表达盒具有心肌特异性表达特性,为进一步监测干细胞向心肌分化研究奠定基础.