smad4 shRNA真核表达质粒的构建及鉴定

• 作者: 卢运萍 吴鹏 周剑锋 桂伶俐 田媛 陈刚 马丁
• 来源期刊: 肿瘤防治研究
• 学科: 医学
• 关键词: 宫颈癌 shRNA smad4
• 年，卷（期）: 2007,（8）
• 所属期刊栏目: 基础研究
• 页码范围: 553-556,643
• 页数: 5页
• 分类号: R737.33
• 字数: 3440字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3971/j.issn.1000-8578.2007.08.002

摘要

目的 针对smad4基因的不同部位,构建不同smad4 shRNA表达质粒载体,在转录后水平抑制smad4的表达,对其克隆进行鉴定并挑选出抑制效率最高的克隆.方法 用DNA重组技术将针对人smad4基因不同部位所设计的3对shRNA序列克隆到真核表达质粒pGenesil-1中,构建smad4 shRNA表达载体pGenesil-smad4-shRNA1、2、3.脂质体介导转染人宫颈癌细胞株HeLa,经G418 筛选抑制smad4表达的稳定细胞克隆.结果 3个smad4 shRNA 表达载体pGenesil-smad4-shRNA1、2、3经限制性酶切及序列分析证明基因插入正确.RT-PCR、Western blotting均证实: 3种shRNA重组质粒中pGenesil-smad4-shRNA2可明显降低细胞内smad4 mRNA丰度及smad4蛋白表达.结论 成功构建了smad4 shRNA表达载体pGenesil-smad4-shRNA1、2、3,并筛选出特异而高效地阻断smad4表达的克隆.此实验结果为进一步研究smad4蛋白分子的生物学功能及应用奠定了基础.