Cx43和GFP双基因共表达重组腺病毒载体的构建和鉴定

• 作者: 光丽霞 刘耀 司英健 张曦 彭贤贵 王庆余 陈幸华 高力 高蕾
• 来源期刊: 重庆医学
• 学科: 生物学
• 关键词: 连接蛋白43 绿色荧光蛋白 同源重组 重组腺病毒载体 构建
• 年，卷（期）: 2007,（10）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 927-929
• 页数: 3页
• 分类号: Q51|Q754
• 字数: 4451字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1671-8348.2007.10.021

摘要

目的 构建间隙连接蛋白43(Cx43)和绿色荧光蛋白(GFP)双基因共表达重组腺病毒载体.方法 利用PCR方法从真核表达载体pcDNA3.0-Cx43扩增Cx43片断,利用DNA重组技术,将目的基因Cx43克隆至含有报告基因GFP的穿梭质粒pAdTrack-CMV,然后在BJ5183细胞中将重组穿梭质粒pAdTrack-Cx43与pAdeasy-l质粒进行同源重组,产生重组腺病毒载体pAd-Cx43-GFP,用PacⅠ单酶切鉴定重组载体;将pAd-Cx43-GFP转入293细胞中包装,荧光显微镜观察报告基因GFP的表达,Western blot方法检测293细胞中Cx43表达.结果 (1)通过PCR方法从载体pcDNA3.0-Cx43扩增出单一条带,与Cx43片断大小相符;(2)重组穿梭质粒pAdTrack-Cx43经NotⅠ/XhoⅠ双酶切后,电泳可见2个大小约为9、1kb条带,证明pAdTrack-Cx43构建成功;(3)同源重组产物pAd-Cx43-GFP经PacⅠ酶切后,电泳可观察到2个大小约为31、4kb左右条带,与预期结果相符,提示同源重组成功;(4)荧光显微镜下观察可见转染pAd-Cx43-GFP后293细胞在培养1～2d即有绿色荧光表达;(5)利用Western Blot法检测到转染pAd-Cx43-GFP后293细胞中Cx43的表达较未转染组增强.结论 Ad-Cx43-GFP重组腺病毒载体构建成功.