HIF-1α和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体的构建及鉴定

• 作者: 吕刚 庄培袁 张玉强 曹阳 李刚 李永明 王岩松 范仲凯
• 来源期刊: 解放军医学院学报
• 学科: 医学
• 关键词: 低氧诱导因子-lα 增强型绿色荧光蛋白 腺病毒载体 基因重组
• 年，卷（期）: 2014,（2）
• 所属期刊栏目: 基础研究
• 页码范围: 166-169,177
• 页数: 5页
• 分类号: R683.2
• 字数: 4825字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.2095-5227.2014.02.020

摘要

目的 构建pAdeno-EGFP-HIF-1 α重组腺病毒载体,探讨其在脊髓损伤中的作用.方法 采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)法扩增目的基因HIF-1 α并亚克隆到含有报告基因EGFP的pShuttle-CMV-EGFP穿梭载体中,得到pShuttle-EGFP-HIF-1 α重组穿梭质粒.将已构建的重组穿梭质粒转移至pAdeno骨架载体上,获得pAdeno-EGFP-HIF-1 α重组腺病毒质粒,继而在H293细胞中扩增,纯化后进行PCR鉴定并测定病毒滴度.结果 pShuttle-EGFP-HIF-1α经KpnI/BamHI双酶切后琼脂糖凝胶电泳可见阳性克隆组在2.5 kb和5.1 kb处出现两条带,而阴性克隆组只有5.1kb处一条带,证明pShuttle-EGFP-HIF-1 α重组穿梭质粒构建成功;pShuttle-EGFP-HIF-1 α重组穿梭质粒与pAdeno载体重组后,经XhoI单酶切后琼脂糖凝胶电泳可见阳性克隆组出现14.5 kb,11.7 kb,2.66 kb,2.6 kb,2.48 kb,2.47 kb,1.45 kb,0.6 kb八条带,而阴性克隆的腺病毒空载组有14 kb,11.8 kb,4.0 kb,2.47 kb,1.45 kb,0.6 kb六条带,证明重组pAdeno-EGFP-HIF1α腺病毒质粒构建成功;pAdeno-EGFP-HIF-1 α重组腺病毒成功包装纯化后经PCR鉴定,实验组和阳性对照组中均扩增到2.5 kb片段,证明目的病毒中成功整合了HIF-1 α基因;TCID50法测定纯化后的病毒滴度为2×1010 PUF/ml.结论 成功构建了HIF-lα和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体,为进一步研究其在脊髓损伤中的作用奠定了基础.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	吕刚		70	279	9.0	11.0
2	李刚		13	30	4.0	4.0
3	李永明		4	5	2.0	2.0
4	王岩松		24	84	5.0	7.0
5	曹阳		33	142	8.0	10.0
6	范仲凯		23	90	5.0	7.0
7	庄培袁		2	3	1.0	1.0
8	张玉强		5	20	3.0	4.0