携带增强绿色荧光蛋白基因的人PRKCB1真核表达载体构建、转染及活性鉴定

• 作者: 周波 李启富 段炼
• 来源期刊: 基础医学与临床
• 学科: 医学
• 关键词: 蛋白激酶Cβ2 真核表达 转染 绿色荧光蛋白 活性
• 年，卷（期）: 2009,（5）
• 所属期刊栏目: 研究论文
• 页码范围: 468-474
• 页数: 7页
• 分类号: R587.1
• 字数: 2850字
• 语种: 中文

摘要

目的 构建携带增强绿色荧光蛋白基因的人PRKCB1真核表达载体并转染人脐静脉内皮细胞,鉴定所表达蛋白活性.方法 从pMD18-T-PRKCB1质粒中,扩增出人PRKCB1并与带有增强绿色荧光蛋白的真核表达载体pReceiver-M29酶切后连接、转化,所获重组体酶切鉴定及测序.按优化的转染参数,将pReceiver-M29-PRKCB1转染人脐静脉内皮细胞,观察荧光蛋白表达,随机视野下计数转染效率.测定激光共聚焦显微镜下胞膜与胞质的荧光强度比值,鉴定其活化转位.结果 构建的真核表达质粒测序与GenBank公布的序列一致.转染后48 h,荧光蛋白表达最佳,转染率为18.6%±1.6%.从胞膜与胞质的荧光强度比值,观察到蛋白的活化转位.结论 成功构建真核表达质粒并转染人脐静脉内皮细胞,观察到绿色荧光蛋白表达及蛋白的转位,为筛选稳定表达人蛋白激酶Cβ2的内皮细胞株,及其蛋白复合体分离提供分子工具.