生长分化因子5基因原核表达质粒构建和表达及其体内成软骨的诱导活性

• 作者: 卢康荣 朴仲贤 朴英杰 王万山 薛侠
• 来源期刊: 中国组织工程研究与临床康复
• 学科: 医学
• 关键词: 生长分化因子5 克隆 表达 活性
• 年，卷（期）: 2009,（50）
• 所属期刊栏目: 研究与报告
• 页码范围: 9842-9845
• 页数: 4页
• 分类号: R318
• 字数: 3827字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1673-8225.2009.50.008

摘要

背景:生长分化因子5在软骨、四肢和关节的发育、形成中起着重要作用,是目前最常应用的研究早期关节发育的标志分子.克隆人生长分化因子5基因可为软骨、关节缺损的修复奠定研究基础.目的:利用基因工程技术在大肠杆菌中表达人生长分化因子5成熟肽,探讨重组蛋白的体内诱导活性.设计、时间及地点:基因水平观察实验,于2006-01,06在南方医科大学分析测试中心完成.材料:人流产胚胎膝关节区软骨组织取自解放军广州军区总医院妇产科,标本获取征得家属同意.10只KM小鼠购自南方医科大学实验动物中心,雌雄各半,体质量18-22 g,6～8周龄.方法:通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从人胚胎软骨组织克隆生长分化因子5完整成熟肽基因,将所得基因片段插入pET22b(+)载体构建重组原核表达载体pET22b(+)-GDF5,重组质粒转化大肠杆菌BL-21进行IPTG诱导表达.凝胶介质镍离子螯合法纯化目的蛋白,植入小鼠后肢股部肌袋内常规苏木精-伊红染色进行生物学活性鉴定.主要观察指标:琼脂糖凝胶电泳观察目的基因表达条带,测序观察目的基因序列,SDD-PAGE电泳观察目的蛋白表达条带,组织学观察生长分化因子5诱导活性.结果:RT-PCR产物长约350 bp,阳性克隆质粒经双酶切可切出约350 bp的片段,测序表明与Genbank中的序列完全一致.SDS-PAGE电泳显示重组子转化菌在相对分子质量14 100位置处出现特异外源蛋白表达带,和成熟肽相对分子质量13 600接近.纯化后体内植入实验组织切片显示,大量的间充质干细胞聚集和增生,并分化成为成软骨细胞,分泌软骨基质并埋入其中变为软骨细胞.结论:通过RT-PCR法从人胚胎软骨组织中成功克隆出人生长分化因子5完整成熟肽基因,可在大肠杆菌中得到高效表达,经纯化后在动物体内具有成软骨诱导活性.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	王万山	南方医科大学比较医学研究所	37	244	7.0	15.0
2	朴仲贤	汕头大学医学院中心实验室	23	49	4.0	5.0
3	薛侠		18	84	6.0	8.0