含anti-erbB2的重组表达载体的构建及其在T细胞株中的表达

• 作者: 布立敬 李红智 胡望雄 苏世振 隋文君
• 来源期刊: 温州医学院学报
• 学科: 医学
• 关键词: erbB2 基因融合 表达载体 T淋巴细胞 克隆,分子
• 年，卷（期）: 2010,（5）
• 页码范围: 431-435
• 分类号: R363
• 字数: 3631字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1000-2138.2010.05.003

摘要

目的:构建含融合基因anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3(ζ)的T细胞株,为erbB2过度表达肿瘤的靶向基因治疗奠定实验基础.方法:利用SWISS MODEL和PHYRE预测该融合蛋白的三级结构.利用PCR分别从重组质粒pPIC9k、pBullet和pLNCX上扩增出3段基因片段,即片段anti -erbB2 scFv、片段Fc-CD28-CD3(ζ)和信号肽序列signal.利用SOE -PCR将3段序列连接形成融合基因片段signal-anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3(ζ).经TA克隆扩增及鉴定后,将融合基因片段与逆转录病毒表达载体pLNCX相连构建重组真核表达载体,脂质体方法转染人T淋巴细胞株Jurkat,G418筛选后用流式细胞术检测融合蛋白稳定表达情况.结果:经预测该融合蛋白在三级结构上可形成功能构象.经PCR、酶切及测序鉴定均证实成功构建重组真核表达载体pLNCX/signal-anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3(ζ).经流式细胞术检测,在Jurkat细胞中表达量达23.68%.结论:应用分子克隆的方法成功地构建了重组真核表达载体pLNCX/anti -erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3(ζ),融合基因能够在T淋巴细胞株中表达,为制备含该融合基因的原代T淋巴细胞,进行erbB2过度表达肿瘤的靶向基因治疗研究奠定了基础.