家蚕肌钙蛋白CⅢ基因的原核表达及其抗体的制备

• 作者: 严巧灵 叶曼 吴祥甫 张耀洲 王丹 陈剑清
• 来源期刊: 农业生物技术学报
• 学科: 农学
• 关键词: 家蚕 肌钙蛋白CⅢ(TnCⅢ) 原核表达 多克隆抗体
• 年，卷（期）: 2010,（6）
• 所属期刊栏目: 研究报告
• 页码范围: 1156-1162
• 分类号: S8
• 字数: 4938字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2010.06.019

摘要

家蚕肌钙蛋白CⅢ(TnCⅢ)是肌钙蛋白C(TnC)的一种亚型结构,本研究利用大肠杆菌表达TnCⅢ融合蛋白,并制备其多克隆抗体.从本实验室的家蚕(Bombyx mori)蛹cDNA文库中搜索到1条编码家蚕肌钙蛋白CⅢ亚型的cDNA序列,将其命名为BmTnCⅢ(Bombyx mori TnCⅢ).该cDNA序列含有完整的ORF,可编码153个氨基酸残基组成的TnCⅢ蛋白.根据该cDNA序列,设计带有BamH Ⅰ和HindⅢ酶切位点的引物,通过RT-PCR的方法从家蚕蛹总RNA中扩增到BmTnCⅢ亚型基因的完整的ORF序列(GenBank登录号为DQ889211),并将其重组到原核表达载体pET-28a相应的酶切位点上.将获得的重组质粒pET-28a-BmTnCⅢ转化大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta(DE3),经1 mmol/L IPTG诱导表达重组蛋白后,在分子量约21 kD处出现融合蛋白条带.用亲和层析的方法纯化目的蛋白His-Tag BmTnCⅢ,并以此为抗原免疫雄性新西兰白兔(Oryctolagus cuniculus),制各了该融合蛋白的多克隆抗体.Western blot结果表明,该多克隆抗体具有较高的特异性,可用于后续的组织分布与定位研究.