猪CD163的分子克隆、原核表达及免疫血清制备

• 作者: 刘文俊 夏晓莉 孙怀昌 宋红芹 张鑫宇 张钰 李秀媛 陈阳
• 来源期刊: 扬州大学学报（农业与生命科学版）
• 学科: 生物学
• 关键词: 猪CD163 cDNA 分子克隆 原核表达 免疫血清
• 年，卷（期）: 2011,（2）
• 页码范围: 6-10
• 分类号: Q785
• 字数: 4097字
• 语种: 中文

摘要

采用生物信息学软件分析猪CD163结构,用RT-PCR从猪巨噬细胞RNA中扩增猪CD163前1 511 bp cDNA片段,再用PCR扩增抗原指数较高的697 bp cDNA片段,将其克隆人质粒载体进行序列测定；将cDNA片段克隆入含细胞毒性T细胞相关抗原4 (CTLA-4)胞外区(IgV)编码序列的原核表达载体,用IPTG诱导重组菌表达；在变性条件下用镍亲和柱纯化融合蛋白,以每只50 μg蛋白的剂量免疫小鼠3次,间接ELISA检测抗体效价；以表达CD163的猪巨噬细胞和不表达CD163的PK-15细胞膜为抗原,用Western blotting验证免疫血清的特异性,以获得猪CD163重组抗原和免疫血清,为猪繁殖与呼吸综合征病毒( PRRSV)感染机制研究提供检测试剂.结果表明:猪CD163的第45～297位氨基酸抗原指数较高,不含疏水性氨基酸集中区；RT-PCR扩增产物的大小与预期结果相符,与发表序列的核苷酸序列同源性为99.5%,氨基酸序列同源性为100%；重组大肠杆菌表达的CTLA-4 IgV-CD163s融合蛋白为预期的43 ku,主要以包涵体形式存在,通过亲和层析和尿素变性/复性获得了可溶性纯化蛋白；免疫小鼠血清的ELISA抗体效价为1；300 000,能在CD163+细胞中检测到预期的120 ku蛋白条带,而在CD163细胞中未检测到相应的蛋白条带.结果提示获得的猪CD163重组抗原和免疫血清可用于PRRSV感染检测.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	李秀媛	扬州大学兽医学院	1	6	1.0	1.0
2	孙怀昌	扬州大学兽医学院	138	1042	15.0	25.0
3	宋红芹	扬州大学兽医学院	23	156	7.0	11.0
4	刘文俊	扬州大学兽医学院	8	20	3.0	4.0
5	张钰	扬州大学兽医学院	23	59	5.0	6.0
6	陈阳	扬州大学兽医学院	52	137	6.0	9.0
7	张鑫宇	扬州大学兽医学院	40	142	6.0	10.0
8	夏晓莉	扬州大学兽医学院	24	78	6.0	8.0