适用于稻瘟病菌基因敲除、过表达和荧光融合蛋白表达载体的构建和使用

• 作者: 刘小红 卢建平 张莉林 李海娇 林福呈
• 来源期刊: 农业生物技术学报
• 学科: 农学
• 关键词: 稻瘟病菌 启动子 载体 基因敲除 基因过表达 荧光融合蛋白
• 年，卷（期）: 2012,（1）
• 所属期刊栏目: 研究资源
• 页码范围: 94-104
• 分类号: S435.111.41
• 字数: 7349字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2012.01.013

摘要

本研究意在提供一系列适于稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)的基因敲除、过表达和荧光蛋白融合表达,并且操作简单、耗时短、稳定可靠的通用载体,为系统研究稻瘟病菌的基因功能提供便利.通过PCR、克隆、酶切、连接等分子生物学方法,克隆了2个在菌丝和附着胞阶段都强力表达的启动子(SOD1启动子和H3启动子)；构建了14种载体:3种稻瘟病菌基因敲除载体(pBS-SUR、pBS-BAR和pBS-NEO)、4种丝状真菌基因过表达载体(pKD5、pKD6、pKD61和pKD8)和7种丝状真菌荧光融合蛋白载体(pKD5-GFP、pKD5-RED、pKD6-GFP、pKD6-RED、pKD7-RED、pKD8-GFP和pKD8-RED);并提供了这些载体在丝状真菌的基因敲除、基因过表达和荧光融合蛋白表达中的应用方法.使用构建的基因敲除载体通过原生质体及ATMT转化最多同时在稻瘟病菌中敲除了4个基因；用pKD5-RED、pKD6-GFP和pK)6-RED转化稻瘟病菌后,发现SOD1启动子和H3启动子控制下的绿色和红色荧光蛋白在稻瘟病菌中强力表达,Real-time PCR结果证实SOD1启动子指导下的eGFPmRNA表达量是β-tubulin的2.5倍,SOD1启动子指导下的DsRED2mRNA表达量是β-tubulin的5.4倍,而H3启动子指导下的DsRED2 mRNA表达量是β-tubulin的20.8倍；MoATG8-DsRED2的融合蛋白(使用pKD6 -RED)可以正确定位MoATG8于小泡附近；SOD1启动子驱动的DsRED2(使用pKD6-RED)可以在稻瘟病菌的菌丝、孢子、附着胞等各个发育阶段表达.这些实验说明14种载体可以用于稻瘟病菌的基因敲除、基因过表达和荧光融合蛋白表达,也可用于镰刀菌等其他丝状真菌的基因功能研究.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	卢建平	浙江大学生命科学学院	26	332	11.0	18.0
2	林福呈	浙江大学生物技术研究所	53	1022	20.0	31.0
3	刘小红	浙江大学生物技术研究所	19	200	6.0	14.0
4	李海娇	浙江大学生物技术研究所	4	30	2.0	4.0
5	张莉林	浙江大学生命科学学院	2	22	1.0	2.0