重组人p75NTR169- Fc抗酶裂嵌合体在大肠杆菌中的表达、纯化及活性鉴定

• 作者: 张俊文 景丽玲 王欣 陈虹
• 来源期刊: 医学研究杂志
• 学科: 医学
• 关键词: p75NTR169-Fc p75NTR β-淀粉样肽(Aβ)
• 年，卷（期）: 2012,（4）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 48-52
• 分类号: R392
• 字数: 4660字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1673-548X.2012.04.015

摘要

目的 制备重组人p75NTR169-Fc融合蛋白,其是一种潜在的抗凋亡和止痛的候选药物.方法 (1)应用PCR法,以本组保存的pUC12-NGFR和人肝cDNA为模板,扩增出p75NTR(1～169氨基酸),IgG Fc(216～433氨基酸)基因顺序,再按照重叠PCR的原则和方法,将两组扩增产物混合变性、复性后再扩增,得到“p75NTR(1～169)-IgG Fc(216～433)”融合基因,缩写为p75NTR169-Fc.(2)应用DNA重组技术将p75NTR169-Fc融合DNA片段经Nco I、EcoR I酶切插入到pET28a(+)原核表达载体中,获得pET28a-p75NTR169-Fc重组质粒.(3)利用pET28a(+)/BL21(DE3)原核表达系统诱导表达目的蛋白,经protein A亲和层析纯化,得到纯度约96％的p75NTR169-Fc重组蛋白质.(4)用MTT方法,以PC12细胞检验不同剂量重组蛋白抗β-淀粉样肽( Aβ25～35)细胞毒的作用.结果 (1)成功构建了pET28a-p75NTR169-Fc/BL21( DE3)表达系统,其高效表达可溶性重组蛋白.实验表明:该重组蛋白p75 NTR169-Fc稳定性好,不再被蛋白酶降解,为单一条带.亲和层析纯化后,分子质量均一.(2) p75 NTR169-Fc与p75NTR竞争结合Aβ(25～35),拮抗Aβ(25～35)对PC12的细胞毒作用.结论 重组人抗酶裂嵌合体蛋白p75NTR169-Fc具有生物学活性,在临床治疗阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)上具有应用前景,系针对神经退行性疾病的新的候选药物.