3TAT-DRBD融合蛋白的原核表达及其siRNA结合活性与穿膜功能的鉴定

• 作者: 刁艳君 刘家云 苏明权 郝晓柯 马越云
• 来源期刊: 中国肿瘤生物治疗杂志
• 学科: 医学
• 关键词: TAT DRBD 融合蛋白 siRNA 前列腺癌 结合活性 穿膜功能
• 年，卷（期）: 2013,（2）
• 所属期刊栏目: 基础研究
• 页码范围: 201-206
• 分类号: R737.25|R730.54|Q78
• 语种: 中文
• DOI: 10.3872/j.issn.1007-385X.2013.02.013

摘要

目的:构建3TAT-DRBD重组载体,表达和纯化融合蛋白,并对其siRNA结合活性和穿膜功能进行初步验证.方法:采用基因合成技术获取靶基因3 TAT-DRBD,并克隆到原核表达载体pET-44b中；用IPTG诱导融合蛋白表达,镍亲和凝胶层析柱纯化融合蛋白,凝血酶切除标签,Western blotting鉴定.凝胶迁移阻滞实验验证DRBD和siRNA的结合能力,激光共聚焦显微镜观察TAT的穿膜能力.结果:限制性酶切和基因测序表明重组质粒pET-44b-3TAT-DRBD构建成功；IPTG诱导后3TAT-DRBD融合蛋白(含Nus标签和S标签)在大肠杆菌中高效表达,可溶性蛋白占菌体总蛋白约80％；成功切除融合标签并纯化了无标签的融合蛋白,经Western blotting鉴定其相对分子质量约为17 000；凝胶迁移阻滞实验证明,融合蛋白3TAT-DRBD能有效结合靶向survivin基因的siRNA(survivin-siRNA)；激光共聚焦显微镜下可见,在TAT的介导下survivin-siRNA穿透胞膜进入前列腺癌PC3细胞的效率明显增高.结论:成功表达并纯化了具有siRNA结合活性与穿膜功能的3TAT-DRBD融合蛋白,为进一步3TAT-DRBD的功能研究及临床应用奠定了基础.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	郝晓柯	第四军医大学附属西京医院全军临床检验医学研究所	322	1751	18.0	23.0
2	马越云	第四军医大学附属西京医院全军临床检验医学研究所	112	451	11.0	15.0
3	苏明权	第四军医大学附属西京医院全军临床检验医学研究所	226	1052	14.0	20.0
4	刘家云	第四军医大学附属西京医院全军临床检验医学研究所	117	731	14.0	20.0
5	刁艳君	第四军医大学附属西京医院全军临床检验医学研究所	5	7	2.0	2.0