对虾白斑综合征病毒可视化环介导等温扩增(LAMP)检测技术的建立与应用

• 作者: 刘加波 庞耀珊 罗思思 范晴 谢丽基 谢志勤 谢芝勋 邓显文
• 来源期刊: 农业生物技术学报
• 关键词: 对虾 白斑综合征病毒(WSSV) 环介导等温扩增技术(LAMP) 检测
• 年，卷（期）: 2013,（8）
• 所属期刊栏目: 技术改进
• 页码范围: 1002-1008
• 页数: 7页
• 字数: 4442字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2013.08.014

摘要

针对当前对虾(Penacus orientalis)养殖业亟需研究开发一种简便快速、敏感特异的检测技术来实现对对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)进行检测监控的现状,本研究根据WSSV基因组ORF120保守区序列,设计合成6条环介导等温扩增(loop mediated isothermal amplification,LAMP)特异性引物,分别为外引物F3/B3、内引物FIP/BIP和环引物LF/LB.利用钙黄绿素/氯化锰作为检测指示剂,通过对反应条件优化,建立了可视化WSSV-LAMP检测方法.在检测中未发生扩增反应时,钙黄绿素被氯化锰螯合,呈淬灭状态.当样品中有WSSV靶基因存在时,大量DNA被合成,并产生同样大量的焦磷酸根离子,此时焦磷酸根离子竞争性与Mn2+结合,形成稳定的不溶性焦磷酸盐沉淀,钙黄绿素被释放而发出肉眼可见的黄绿色荧光.该扩增一次性反应约60 min即可完成对待检样品的检测.经测定,本方法能特异性地检测出阳性样品中的WSSV目的基因,并能通过扩增产物所产生的黄绿色变化与阴性样品区别;本技术对目的基因的最低检测量为1fg.在临床检测试验中,WSSV-LAMP与世界动物卫生组织(OIE)推荐的WSSV-PCR检测方法均能从250份对虾样品中,同时检测到15份编号相同的阳性样品,符合率达100％.除此之外,WSSV-LAMP还能从另外3份PCR检测为阴性的样品中检测到目的基因.比较这两种方法的阳性检出率,WSSV-LAMP为7.2％(18/250),WS SV-PCR为6.0％(15/250),WSSV-LAMP对自然感染的临床样品阳性检出率要比WSSV-PCR高.说明WSSV-LAMP在病毒含量较低的临床样品检测中比OIE推荐的PCR方法具有更高的技术优势,能在对虾养殖生产上的临床诊断、育种及口岸检疫,甚至海洋生态监测中对WSSV进行现场检疫.