刚地弓形虫蛋白质二硫键异构酶基因的克隆及原核表达

• 作者: 关丽 刘红丽 孟晓丽 张铁娥 李润花 殷丽天 殷国荣 王海龙
• 来源期刊: 环境与健康杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 刚地弓形虫 蛋白质二硫键异构酶 克隆 原核表达 免疫反应性
• 年，卷（期）: 2013,（10）
• 所属期刊栏目: 基础与应用
• 页码范围: 875-878
• 分类号: R994.6
• 语种: 中文

摘要

目的 克隆刚地弓形虫蛋白质二硫键异构酶(TgPDI)基因,原核表达、纯化重组TgPDI蛋白,并分析其免疫反应性.方法 制备弓形虫RH株速殖子总RNA,根据TgPDI基因全长编码序列(登录号为AJ306291.2)的开放阅读框设计合成引物,并进行逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),扩增产物经双酶切后连接入pET-30a(+)载体,重组质粒pET-30a(+)-TgPDI转化大肠埃希菌(E.coli)DH5α,阳性菌落经PCR、双酶切并测序鉴定.将重组质粒pET-30a(+)-TgPDI转化至大肠埃希菌Rosetta(DE3),并加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物;分别以抗His抗体和兔抗弓形虫血清为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)鉴定重组蛋白及其免疫反应性;重组蛋白His-TgPDI通过Ni2琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化,纯化蛋白经SDS-PAGE分离,考马斯亮蓝染色结合凝胶成像系统分析其纯度.结果 RT-PCR扩增产物约为1 427 bp.菌落PCR、双酶切及测序结果显示,重组质粒pET-30a(+)-TgPDI构建成功.SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导获得约57kDa的可溶性重组蛋白.Western blotting结果表明,诱导表达的重组蛋白能被兔抗弓形虫血清识别.亲和纯化后获得纯度大于95％的重组TgPDI蛋白质.结论 克隆得到弓形虫PDI基因,原核表达并纯化出该基因编码的蛋白,且该重组蛋白具有免疫反应性.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	王海龙	山西医科大学寄生虫学教研室	60	295	9.0	14.0
2	殷国荣	山西医科大学寄生虫学教研室	125	764	13.0	20.0
3	刘红丽	山西医科大学寄生虫学教研室	63	337	10.0	15.0
4	孟晓丽	山西医科大学寄生虫学教研室	65	406	10.0	17.0
5	殷丽天	山西医科大学生理学系	20	62	4.0	7.0
6	李润花	太原师范学院生物系	21	75	6.0	7.0
7	张铁娥	山西医科大学寄生虫学教研室	5	5	1.0	2.0
8	关丽	山西医科大学寄生虫学教研室	5	8	2.0	2.0