人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165双基因真核表达载体的构建与鉴定

• 作者: 丰慧根 李卫东 林俊堂 栗炳南
• 来源期刊: 中国组织工程研究
• 学科: 医学
• 关键词: 组织构建 组织工程 胶质细胞源性神经营养因子 血管内皮生长因子165 真核双表达载体 内部核糖体进入位点 转染 双PCR
• 年，卷（期）: 2014,（29）
• 所属期刊栏目: 技术与方法 -- 组织构建与生物活性因子
• 页码范围: 4675-4682
• 页数: 8页
• 分类号: R318
• 字数: 2447字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.29.015

摘要

背景：人胶质细胞源性神经营养因子(glial&nbsp；cel line - derived neurotrophic factor， GDNF)和血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165， VEGF 165)在细胞分化过程中有重要作用。<br>　　目的：构建双基因共表达载体pIRES 2-GDNF-VEGF 165并对其进行鉴定。<br>　　方法：采用PCR法从人外周血单个核细胞的基因组DNA中获取人胶质细胞源性神经营养因子基因，然后将人胶质细胞源性神经营养因子的cDNA片段插入到pIRES 2-EGFP多克隆位点构建成为pIRES 2-GDNF-EGFP。人血管内皮生长因子165 cDNA片段是通过双PCR的方法从pIRES 2-VEGF 165-EGFP质粒中获取，接着将血管内皮生长因子165 cDNA片段以替换 EGFP 的方式插入pIRES 2-BDNF-EGFP中，最后构建成为含有内部核糖体进入位点(IRES)的pIRES 2-GDNF-VEGF 165双基因共表达载体。通过双酶切和DNA测序方法对其鉴定，将重组的双基因共表达载体感染HEK293细胞，利用 RT-PCR 与Western-blot 方法检测双基因的表达。<br>　　结果与结论：DNA测序显示，提取的人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165均与基因库报道序列一致，相对分子质量分别为636 bp和576 bp。构建的pIRES 2-GDNF-VEGF 165双基因共表达载体经Bgl II/Bam HI切出GDNF条带，经 Bam HI/Not I 双酶切后切出IRES-VEGF 165片段，经Bgl II/Not I双酶切后切出 GDNF-IRES-VEGF 165片段。RT-PCR与Western-blot方法检测显示，此载体转染后，HEK293细胞均能表达人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165 mRNA和蛋白。说明实验成功构建了能表达人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165的双基因真核表达载体。

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	丰慧根	新乡医学院生命科学技术学院	75	167	6.0	8.0
2	林俊堂	新乡医学院生命科学技术学院	61	101	5.0	6.0
3	李卫东	新乡医学院生命科学技术学院	7	2	1.0	1.0
4	栗炳南	新乡医学院生命科学技术学院	4	1	1.0	1.0