基于 Cre-LoxP 系统的新型慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P 的构建与鉴定

• 作者: 吴彩红 夏景波 王健欢 陈卓莹 高文勇 齐绪峰 龙颖妍
• 来源期刊: 暨南大学学报（自然科学与医学版）
• 学科: 生物学
• 关键词: 慢病毒表达载体 Cre-LoxP 系统 绿色荧光蛋白基因 嘌呤霉素抗性基因
• 年，卷（期）: 2015,（2）
• 所属期刊栏目: 医学
• 页码范围: 160-167
• 页数: 8页
• 分类号: Q782|Q784|Q786
• 字数: 5872字
• 语种: 中文
• DOI: 10.11778/j.jdxb.2015.02.013

摘要

目的：基于 Cre-LoxP 系统构建携带 EGFP 及 Puromycin 抗性基因，并带有巨细胞病毒（CMV）及翻译延伸因子1α（EF1α）双启动子的新型慢病毒表达载体，为基因治疗及基因功能研究提供有效的慢病毒载体系统．方法：以已经插入 LoxP 序列的 pLOX-TERT-iresTK 慢病毒载体为模板，用 SpeI 与 KpnI 进行双酶切，去除 TERT-iresTK片段，然后与人工设计合成的多克隆位点片段连接，构建 pLOX-MCS 表达载体．同时，以 pB513载体为模板扩增EF1α-EGFP-Puro 表达框（带有 BamHI 及 KpnI 酶切位点），然后与经过 BamHI 及 KpnI 双酶切的 pLOX-MCS 载体连接，进而构建 pLOX-CMV-EF1α-EGFP-Puro（简称 pLOX-CMV-E ／P）载体．将 pLOX-CMV-E ／P 载体与慢病毒包装载体pCMVR8．74及 pMD2．G 共转染293T 细胞，包装病毒进行报告基因的功能分析．结果：菌落聚合酶链式反应（PCR）、酶切鉴定及测序结果均与预期结果一致，绿色荧光蛋白及抗药性基因均有较好的活性与功能．结论：成功构建了pLOX-MCS 及 pLOX-CMV-E ／P 慢病毒表达载体，为基因治疗及基因功能研究提供有效的慢病毒表达系统．