拟南芥阿拉伯糖-5-磷酸异构酶的原核表达、纯化及酶催化特性

• 作者: 吴林军 屈亚平 张智俊 王蕾 王超莉
• 来源期刊: 生物工程学报
• 关键词: 拟南芥 阿拉伯糖-5-磷酸异构酶 重组表达 分离纯化 MALDI-TOF MASS 酶学性质
• 年，卷（期）: 2016,（8）
• 所属期刊栏目: 工业生物技术
• 页码范围: 1060-1069
• 语种: 中文
• DOI: 10.13345/j.cjb.150479

摘要

阿拉伯糖-5-磷酸异构酶(KdsD)是2-酮-3-脱氧辛糖酸(KDO)生物合成途径的第一个关键限速酶,通过无缝克隆技术将拟南芥KdsD基因构建至原核表达载体pET-HTT,经过IPTG诱导,在大肠杆菌BL21 (DE3)中获得了大量重组蛋白的可溶性表达;表达产物经Ni-NTA亲和层析和分子筛层析(SEC)方法进行酶蛋白的分离纯化步骤,得到纯度85％以上的高纯度酶;分子筛层析结果发现纯化后的目的蛋白KdsD在溶液中主要以多聚体、二聚体和单体形式存在,这同微生物来源KdsD酶在溶液中以四聚体形式存在很大差异;进一步使用Western blotting和MALDI-TOF MASS技术对纯化的蛋白进行鉴定;测定了拟南芥KdsD酶学性质,证明该酶催化反应的最适pH值为8.0,最适作用温度为37℃,各种金属离子在低浓度均对酶活性存在不同程度的抑制作用,其中以Co2+、Cd2+对酶活性的抑制作用最强,而5 mmol/L金属螯合剂EDTA对酶有激活作用.此外,以阿拉伯糖-5-磷酸(A5P)为底物时,拟南芥KdsD酶动力学常数Vmax和Km值分别为0.18 mmol/(L.min)、0.16 mmol/L,比较发现该酶与底物的亲和性高于大肠杆菌KdsD.以上研究结果为KdsD蛋白结构与功能及其在新型抗生素研制领域中的工业化应用奠定了基础.