无标记转Fat-1基因真核表达载体的构建及转基因绵羊细胞系的建立

• 作者: 朱和平 李璐 王丙萍 王瑞瑶 苏小虎 那顺温都乐 闫涛 阿力玛 齐贵春
• 来源期刊: 生物工程学报
• 关键词: Fat-1基因 真核表达载体 筛选标记 phiC31整合酶
• 年，卷（期）: 2016,（2）
• 所属期刊栏目: 组织工程与细胞培养
• 页码范围: 212-221
• 语种: 中文
• DOI: 10.13345/j.cjb.150149

摘要

为了建立无筛选标记基因的转Fat-1基因绵羊细胞系,本研究将PCR克隆得到的Fat-1基因,合成的attB、Loxp序列并克隆入pN1-EGFP框架载体,得到可删除筛选标记基因的pEGFP-N 1-Fat-1真核表达载体.体外转录合成phiC31整合酶mRNA并与线性化的pEGFP-N 1-Fat-1载体共转染绵羊胎儿皮肤成纤维细胞,G418筛选得到表达绿色荧光的单克隆,再利用pET-28a-His-NLS-TAT-Cre质粒诱导Cre重组蛋白表达,将纯化后的Cre穿膜肽转导表达绿色荧光的单克隆细胞,将荧光淬灭的细胞系扩繁,提取基因组DNA,进行PCR及测序鉴定,得到无标记转Fat-1基因绵羊胎儿皮肤成纤维细胞系,为生产无筛选标记基因的转基因绵羊奠定基础.