鸡Visfatin蛋白的原核表达、纯化及其活性研究

• 作者: 刘小军 商鹏飞 孙桂荣 康相涛 张盼盼 田亚东 田方圆 蒋瑞瑞 韩瑞丽
• 来源期刊: 畜牧兽医学报
• 学科: 农学
• 关键词: 鸡重组Visfatin 克隆 原核表达 条件优化 3T3-L1
• 年，卷（期）: 2016,（9）
• 所属期刊栏目: 遗传繁育
• 页码范围: 1785-1794
• 页数: 10页
• 分类号: S831.2
• 字数: 7669字
• 语种: 中文
• DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2016.09.006

摘要

本试验旨在通过克隆Visfatin基因,将其在原核表达系统中表达并纯化,通过3T3-L1细胞的分化验证其活性,成功获得鸡重组Visfatin蛋白.以AA肉仔鸡肝组织总RNA为模板,qRT-PCR扩增Visfatin基因,转化进入pGEM(R)-T载体,再与原核表达载体pET-30a连接转化,获取含pET-30a-Visfatin重组质粒的E.coli BL21(DE3)表达菌株.以IPTG诱导重组菌株,优化表达条件,SDS-PAGE鉴定表达情况.采用镍离子亲和层析对Vis-fatin蛋白进行纯化,Western blot鉴定表达蛋白,并通过3T3-L1细胞的分化情况鉴定表达蛋白Visfatin的活性.结果,通过Nco Ⅰ、Xho Ⅰ酶切获得的结果与预期目的条带大小相符,成功构建pET-30a-Visfatin表达载体.SDS-PAGE检测结果表明,在培养基pH为8.0,IPTG终浓度为0.4 mmol·L-1,30℃条件下,诱导10～12 h时可溶性蛋白表达量最大.通过镍离子层析纯化Visfatin蛋白,在SDS-PAGE的60 ku处可见一条与预期一致的蛋白条带.Western blot证明纯化蛋白可与6*His标签特异性结合.油红O染色结果表明,与对照组相比Visfatin诱导的3T3-L1细胞有更多的脂滴形成.qRT-PCR结果显示,在3T3-L1细胞分化过程中,Visfatin作用下标志基因PPARγ、aP2、FAS和C/EBPα的表达量显著增加(P＜0.05).本研究成功建立了一套标准化的鸡Visfatin重组蛋白表达程序,获得了具有生物活性的鸡Visfatin,为其在家禽领域的进一步研究奠定了基础.