核转录因子及其突变基因的克隆与GST融合蛋白的表达纯化及磷酸化活性的检测

• 作者: 俞飞远 刘道然 尧月 巫丹丹 戴丽娟 梁展羚 臧中盛 蔡娜丽 许彦鸣 赛留羊
• 来源期刊: 汕头大学医学院学报
• 学科: 生物学
• 关键词: IκBα IκBα (S32,36A) 原核表达 蛋白纯化 磷酸化活性
• 年，卷（期）: 2017,（2）
• 所属期刊栏目: 基础医学
• 页码范围: 65-68
• 页数: 4页
• 分类号: Q78
• 语种: 中文

摘要

目的:原核表达IκBα及κBα (S32,36A)基因,纯化获得GST-IκBα及GST-Iκ Bα (S32,36A)融合蛋白.方法:利用PCR扩增含有酶切位点EcoR Ⅰ及NotⅠ的IκBα基因,将其装入pGEX-5X-1原核表达载体中.通过点突变获得pGEX-5X-1-Iκ Bα(S32,36A)质粒.将正确的重组载体转入大肠杆菌BL21 (DE3),用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达蛋白,再用Glutathione Sepharose 4B beads纯化GST融合蛋白,最后通过Western Blot鉴定纯化后的融合蛋白.结果:成功构建了pGEX-5X-1-IκBα及pGEX-5X-1-IκBα (S32,36A)原核表达载体.在37℃条件下,0.lmmol/L的IPTG能够诱导表达大量可溶性GST-IκBα与GST-IκBα (S32,36A)蛋白;纯化的融合蛋白可被抗IκBα的单克隆抗体特异性识别.最后通过体外激酶试验验证了IκBα能被HeLa细胞中存在的上游激酶所磷酸化,而第32,36位丝氨酸突变后IκBα不具有磷酸化活性.结论:纯化的GST-IκBα/Iκ Bα (S32,36A)蛋白具有生物学活性,可用于后续的生物学研究.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	蔡娜丽		5	0	0.0	0.0
2	俞飞远		2	0	0.0	0.0
3	巫丹丹		4	0	0.0	0.0
4	臧中盛		1	0	0.0	0.0
5	戴丽娟		1	0	0.0	0.0
6	尧月		1	0	0.0	0.0
7	赛留羊		1	0	0.0	0.0
8	梁展羚		1	0	0.0	0.0
9	刘道然		5	0	0.0	0.0
10	许彦鸣		5	0	0.0	0.0