慢病毒介导shRNA沉默Nicastrin基因的人永生化角质形成细胞模型构建

• 作者: Yang Brooks 何艳艳 张婉璐 张晓峰 徐浩翔 李莉 李诚让 李黎明 毛秋霞 王宝玺 贾苇雪 陈旭
• 来源期刊: 中华皮肤科杂志
• 关键词: 化脓性汗腺炎 RNA干扰 慢病毒属 角蛋白细胞 NCT基因 模型,细胞
• 年，卷（期）: 2017,（4）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 268-272
• 页数: 5页
• 字数: 3787字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2017.04.008

摘要

目的 构建Nicastrin(NCT)基因的RNA干扰慢病毒表达载体,并在人永生化角质形成细胞(HaCaT细胞)上鉴定其沉默效率,构建NCT基因稳定下调的人永生化角质形成细胞模型,为后续研究NCT基因下调对角质形成细胞的生物学行为影响奠定实验基础.方法 设计3个靶向NCT基因特异性短发卡RNA(shRNA)表达序列并连接到慢病毒表达质粒pGLV3/H 1/GFP+ Puro中,成功构建慢病毒重组表达质粒,并通过测序鉴定.将构建的重组表达质粒与包装质粒共转染293T细胞,产生慢病毒颗粒,并测其滴度.将HaCaT细胞分为空白组(未感染病毒)、阴性对照组(NC组,感染空载病毒LV3-shNC)和干扰组(感染NCT-shRNA1、2、3慢病毒).流式细胞仪检测慢病毒转染效率,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、Western印迹检测靶基因的沉默效率,筛选出沉默效果最佳的干扰序列.结果 测序表明,NCT-shRNA慢病毒重组表达质粒构建成功.重组表达质粒与包装质粒共转染293T细胞后产生的慢病毒颗粒滴度为109 TU/ml.慢病毒感染HaCaT细胞后,流式细胞仪检测,慢病毒转染效率大于95％.qRT-PCR结果,与NC组相比,干扰组NCT mRNA表达量明显下降,其中NCT-shRNA1组NCT基因沉默效果最佳,干扰效率达到75％.Western印迹结果,与NC组相比,shRNA1组NCT蛋白表达抑制率为71.7％.结论 成功筛选出高效NCT-shRNA干扰序列,构建NCT-shRNA慢病毒重组表达载体,并构建NCT基因稳定下调的人永生化角质形成细胞模型.