猪ELF4基因的克隆、蛋白表达及其多克隆抗体制备

• 作者: 唐青海 姚伦广 李晓楠 李羽 王瑾 王雪雨 谷雅静 阚云超
• 来源期刊: 畜牧兽医学报
• 学科: 农学
• 关键词: 猪ELF4蛋白 原核表达 免疫
• 年，卷（期）: 2017,（3）
• 所属期刊栏目: 遗传育种
• 页码范围: 425-435
• 页数: 11页
• 分类号: S828|S813.1
• 字数: 6486字
• 语种: 中文
• DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2017.03.005

摘要

本研究旨在克隆猪转录因子ELF4基因,体外表达ELF4蛋白并制备抗该蛋白的多克隆抗体.采用RT-PCR扩增猪ELF4基因,运用生物信息学软件分析其核苷酸和编码氨基酸序列特征,将其克隆至原核表达载体pET28a,构建重组表达载体pET28a-pELF4,转化Rosetta(DE3)菌株,在不同温度、IPTG浓度、诱导时间等条件下进行诱导表达,采用SDS-PAGE和Western blot分析蛋白表达,重组pELF4蛋白(rpELF4)经纯化免疫鸡制备抗pELF4抗体.结果表明,pELF4开放阅读框为1 989 bp (GenBank No.:KU097322),编码662个氨基酸,该基因与已经测定的人、牛、小鼠的ELF4的核苷酸相似性依次为89.4％、90.7％和81.1％,与牛等大动物的亲缘关系相对较近,与人和小鼠亲缘关系相对较远;结果显示,成功表达了重组蛋白pELF4,rpELF4分子量为95 ku,该蛋白以可溶性和包涵体两种形式存在,在37℃条件下,以终浓度为0.8 mmol·L-1IPTG诱导8h包涵体表达量达到最高.第4次免疫后第13天,鸡抗rpELF4抗体滴度达到1∶256 000倍以上.本试验利用原核表达系统成功制备了重组pELF4蛋白,并制备了免疫活性和特异性良好的鸡抗pELF4多克隆抗体,为该蛋白生物学功能及相关疾病研究提供了基础材料.