热激启动子驱动的真核表达质粒pHSP-shPLK1-GFP的构建与鉴定

• 作者: 余水生 柯友群 程里 荆珏华
• 来源期刊: 安徽医科大学学报
• 学科: 医学
• 关键词: 骨肉瘤 RNA干扰 质粒构建 热疗 热激启动子
• 年，卷（期）: 2017,（6）
• 所属期刊栏目: 基础医学研究
• 页码范围: 791-796
• 页数: 6页
• 分类号: R738.1
• 语种: 中文
• DOI: 10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2017.06.003

摘要

目的 构建热激启动子(pHSP)驱动的靶向敲低Polo样蛋白激酶1(PLK1)的真核表达质粒,并观察其对骨肉瘤U2OS细胞增殖的影响.方法 首先合成热休克蛋白HSP70的启动子,克隆至带有绿色荧光蛋白(GFP)标签的真核表达质粒pEGFP-C1中,利用pHSP替换原有的CMV启动子,构建真核表达载体pHSP-GFP;其次,利用RNA干扰技术合成以plk1基因为靶向目标的shRNA,将其定向克隆至真核表达载体pHSP-GFP中形成重组质粒pHSP-shPLK1-GFP;另外设计一组阴性对照质粒pHSP-NC-GFP,最后,利用脂质体Lipo2000转染的方法将质粒转染至U2OS细胞,非热激组细胞正常培养,热激组及阴性对照组细胞42 ℃加热2 h,通过细胞免疫荧光染色实验检测GFP的表达,从而确定pHSP的驱动能力,采用Real-time PCR法检测细胞内plk1的mRNA表达水平,Western blot法检测PLK1蛋白表达水平,MTT法检测重组质粒对U2OS细胞增殖的影响.结果 成功构建了pHSP驱动的真核表达质粒pHSP-shPLK1-GFP;细胞免疫荧光染色实验结果显示pHSP可正常驱动gfp基因的表达,且GFP蛋白定位在胞质中;Real-time PCR结果显示热激组细胞plk1基因表达量明显降低,与非热激组及阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);Western blot结果显示热激组细胞PLK1蛋白表达量比非热激组及阴性对照组低(P<0.05);MTT结果显示热激组细胞的增殖活性被明显抑制,与非热激组及阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.05).结论 pHSP驱动的真核表达质粒pHSP-shPLK1-GFP能在U2OS细胞中表达,在42 ℃加热条件下,该重组质粒呈现更强的下调plk1基因表达和抑制增殖作用.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	荆珏华	安徽医科大学第二附属医院骨科	136	529	11.0	14.0
2	余水生	安徽医科大学第二附属医院骨科	12	17	2.0	4.0
3	程里	安徽医科大学第二附属医院骨科	10	21	2.0	4.0
4	柯友群	安徽医科大学第二附属医院骨科	3	2	1.0	1.0