脂肪酶lipAB操纵子在防御假单胞菌中的克隆、表达及活性研究

• 作者: 丁学知 夏立秋 张友明 方倩 李建伟 涂强 潘登 谢芝玲 陈汉娜
• 来源期刊: 激光生物学报
• 学科: 生物学
• 关键词: B.glumaePG1 lipAB Red/ET同源重组 P.protegensPf-5 异源表达
• 年，卷（期）: 2018,（5）
• 所属期刊栏目: 研究论文
• 页码范围: 442-450
• 页数: 9页
• 分类号: Q78
• 字数: 6545字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1007-7146.2018.05.009

摘要

对荚壳伯克氏菌PG1(Burkholderia glumae PG1)基因组中的脂肪酶操纵子lipAB片段进行直接克隆,构建含有脂肪酶基因的分泌表达载体,实现其在防御假单胞菌Pf-5(Pseudomonas protegens Pf-5)中的异源表达,并研究重组工程菌的胞外脂肪酶活性.利用Red/ET直接克隆技术获得克隆载体p15A-cm-lipAB;再通过亚克隆技术构建重组表达载体pBBR1-km-lipAB和pBBR1-km-Papra-lipAB,将这两个表达载体分别电转至Pf-5中,通过卡那霉素或者阿伯拉霉素抗性筛选得到转化子,以三丁酸甘油酯平板扩散法和对硝基苯酚法检测脂肪酶酶活,并通过实时荧光定量PCR检测启动子的替换对lipA表达的影响.本研究从PG1中成功克隆了脂肪酶操纵子lipAB(GenBank accession number:AJK49931.1 and AJK49932.1);成功构建了重组工程菌Pf-5/pBBR1-km-lipAB和Pf-5/pBBR1-km-Papra-lipAB,并成功检测到两株工程菌的胞外脂肪酶活性;以LB培养基培养至24 h时,启动子优化后lipA基因表达量是原始水平的2.1倍;在LB培养基摇瓶发酵至66 h时,Pf-5/pBBR1-km-lipAB的脂肪酶酶活最高且为13.51 U/mL,而Pf-5/pBBR1-km-Papra-lipAB的酶活为46.85 U/mL,是Pf-5/pBBR1-km-lipAB的3.47倍.初步实现基因lipA在Pf-5中的表达,发现组成型启动子Papra比lipAB的原始启动子PlipAB效率更高,为将来实现规模化生产奠定了技术基础.