慢病毒介导的bta-miR-222稳定过表达MDBK细胞株的构建及鉴定

• 作者: 主性 刘茂军 嵇辛勤 李基棕 李文良 毛立 肖芳 郝飞 钟纯燕
• 来源期刊: 中国兽医科学
• 学科: 农学
• 关键词: bta-miR-222 MDBK细胞 慢病毒
• 年，卷（期）: 2019,（1）
• 所属期刊栏目: 预防兽医学
• 页码范围: 50-57
• 页数: 8页
• 分类号: S852.65
• 语种: 中文
• DOI: 10.16656/j.issn.1673-4696.2019.0001

摘要

拟获取稳定表达bta-miR-222的MDBK细胞株,为后续探索bta-miR-222在MDBK细胞中的作用奠定基础.本研究使用PCR技术,从MDBK细胞基因组与pEGFP-N1质粒中扩增pri-bta-miR-222和GFP片段,胶回收,先克隆于pMD18-T载体中,转化入大肠杆菌,酶切鉴定及测序正确,再克隆于pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体,构建含bta-miR-222基因的miRNA慢病毒重组质粒pCDH-miR-222-GFP.将pCDH-miR-222-GFP与两个包装质粒PSP、PMD共转染293T细胞,制备含bta-miR-222基因的重组慢病毒VPCDH+miR-222.用制备成功的慢病毒VPCDH+miR-222感染MDBK细胞,经Puromycin嘌呤霉素筛选,荧光显微镜观察感染效率.结果显示,pCDH-miR-222-GFP过表达质粒构建成功,序列比对符合率达100％.将pCDH-miR-222-GFP、PSP和PMD共转染后,通过荧光显微镜观察到293T细胞分布大量的荧光,说明成功构建了重组慢病毒VPCDH+miR-222,经Puromycin嘌呤霉素筛选10代后,VPCDH+miR-222在MDBK细胞中仍具有感染效率.本研究成功获取稳定表达bta-miR-222的MDBK细胞株,为进一步研究bta-miR-222在病毒感染MDBK细胞中的功能奠定了基础.