新型双功能谷胱甘肽合成酶的真核和原核表达

• 作者: 张赛南 李佳慧 杨芳芳 王珍 王首锋
• 来源期刊: 浙江大学学报（理学版）
• 学科: 生物学
• 关键词: 新型双功能谷胱甘肽合成酶 发酵表达 谷胱甘肽
• 年，卷（期）: 2019,（4）
• 所属期刊栏目: 声明科学
• 页码范围: 474-481
• 页数: 8页
• 分类号: Q87
• 字数: 6389字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3785/j.issn.1008-9497.2019.04.014

摘要

通过裂解无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)菌体细胞得到基因组DNA.根据GenBank上已发表的无乳链球菌(菌种编号ATCC13813)新型双功能谷胱甘肽合成酶基因(gshF)的核酸序列与2种不同表达载体多克隆位点序列,分别设计引物F1、R1和F2、R2,再以总DNA为模板,经过特异性PCR扩增出长度约为2200 bp的目的基因.随后分别对目的基因gshF和2种表达载体进行双酶切、连接等操作,得到表达载体pPIC9K-gshF与pET-gshF.用Sal I线性化表达载体pPIC9K-gshF后电转至毕赤酵母GS115中.经MD平板筛选重组子、菌落PCR鉴定阳性菌株、G418抗性梯度平板筛选多拷贝菌株,最终在4.0 mg·mL-1 G418抗性平板上筛选出阳性菌株.用甲醇终浓度为2％的BMMY培养基诱导该阳性菌株表达,每隔12 h取样并添加甲醇,96 h后离心收集发酵上清,经SDS-PAGE蛋白电泳显示:在85 kDa处出现1条明显蛋白带,大小与预期GshF蛋白一致.重组菌BL21-pET-gshF用IPTG诱导表达,先在37℃下培养90 min,再加入IPTG至1 mmol·L-1后诱导7 h,离心收集表达产物并对重组菌进行超声破碎处理后,进行SDS-PAGE蛋白电泳,同样在85 kDa处有1条蛋白带.采用Bradford法测定2种表达产物上清的蛋白量,其中重组酵母表达上清中蛋白量为0.46 mg·mL-1,重组大肠杆菌表达产物破壁后的蛋白量为1.46 mg·mL-1.测定并比较2种不同表达方式所得酶活,发现GshF在毕赤酵母表达中的比酶活仅为14.15 U·mL-1,经原核表达后比酶活可达62.15 U·mL-1.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	王珍		14	8	2.0	2.0
2	李佳慧	浙江大学基础医学系	4	3	1.0	1.0
3	王首锋	浙江大学基础医学系	6	42	3.0	6.0
5	杨芳芳	浙江大学基础医学系	8	34	3.0	5.0
6	张赛南	浙江大学基础医学系	3	1	1.0	1.0