葡萄霜霉病菌实时荧光定量PCR检测体系的建立和应用

• 作者: 丁宁 吕苗苗 李文学 石华荣 肖瑞刚 顾沛雯
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 葡萄霜霉病菌 cox2 实时荧光定量PCR 潜伏侵染 定量检测
• 年，卷（期）: 2019,（9）
• 所属期刊栏目: 植物保护
• 页码范围: 1529-1540
• 页数: 12页
• 字数: 9014字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2019.09.005

摘要

[目的]葡萄霜霉病是葡萄生产上重要的单年流行病害,研究旨在构建葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)的实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测体系,为葡萄霜霉病的早期诊断和预测预报提供依据.[方法]依据GenBank中葡萄霜霉病菌cox2基因序列设计1对特异性引物(F-cox-Pv/R-Pv),建立并优化常规PCR和real-time PCR反应体系,利用葡萄霜霉病菌、葡萄炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、葡萄白粉病菌(Uncinula necator)、葡萄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、葡萄白腐病菌(Coniella diplodiella)、葡萄溃疡病菌(Botryosphaeria dothidea)、白菜黑斑病菌(Alternaria brassicae)、辣椒炭疽病菌(C.capsica)、甘草根腐病菌(Fusarium solani)、西葫芦白粉病菌(Sphaerotheca fuliginea)、番茄菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、马铃薯干腐病菌(F.equiseti)、西瓜枯萎病菌(F.oxysporum)、呛茨木霉(Trichoderma harzianum)等14种葡萄及其他作物病原菌和拮抗菌的菌丝DNA进行常规PCR和real-time PCR特异性检测,并对灵敏度和可重复性进行评价.运用已构建的real-time PCR体系对人工接种葡萄霜霉病菌的潜育期叶片内病原菌DNA进行定量检测,利用SPSS 19.0软件分析接种时间与叶片内葡萄霜霉病菌潜伏侵染量的关系.[结果]研究设计的引物特异性高,常规PCR仅对葡萄霜霉病菌DNA有扩增条带,为139 bp;real-time PCR检测结果表明该对引物对葡萄霜霉病菌有唯一的产物吸收峰,对其他供试菌株均未检测到产物吸收峰.常规PCR检测的灵敏度为10 pg·μL-1,real-time PCR的灵敏度可达到0.1 pg·μL-1,是常规PCR检测灵敏度的1 00倍.以携带目的基因片段的重组质粒为标准品,构建real-time PCR循环阈值(Ct)与模板浓度的线性关系,标准曲线y=42.27-3.36x,相关系数R2=0.997,扩增效率为98.50％,线性范围达7个数量级,在2.4×103-2.4×109 copies/μL呈现良好的线性关系.对人工接种葡萄霜霉病菌的潜育期叶片内病原菌DNA进行real-time PCR检测,结果表明叶片内病原菌潜伏侵染量随接种时间的变化呈指数关系增长,y=6.34×104.e0.084x,相关系数R2=0.936.该real-time PCR检测体系在接种6h后就可以检测到葡萄霜霉病菌DNA,检测量为5.68×104 copies/μL病原菌DNA.[结论]构建的葡萄霜霉病菌real-time PCR检测体系的灵敏度远高于常规PCR,且特异性强、重复性好,其Ct值与模板浓度呈较好的线性关系,扩增效率高,可用于定量检测葡萄霜霉病菌的潜伏侵染量.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	顾沛雯	宁夏大学农学院	59	312	10.0	13.0
2	吕苗苗	宁夏大学农学院	8	17	3.0	3.0
3	李文学	宁夏大学农学院	8	11	2.0	3.0
4	肖瑞刚	宁夏大学葡萄酒学院	1	4	1.0	1.0
5	丁宁	宁夏大学农学院	1	4	1.0	1.0
6	石华荣	宁夏大学葡萄酒学院	1	4	1.0	1.0