稳定干扰Drp1基因的慢病毒载体质粒及神经母细胞瘤细胞株构建

• 作者: 冯琬迪 周梦琪 孙红梅 柴原 盖聪 马浩洁
• 来源期刊: 山东医药
• 学科: 医学
• 关键词: Drp1基因 RNA干扰 慢病毒载体质粒 神经母细胞瘤细胞株 帕金森病
• 年，卷（期）: 2019,（24）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 1-4
• 页数: 4页
• 分类号: R745
• 字数: 3586字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1002-266X.2019.24.001

摘要

目的 构建稳定干扰Drp1基因的慢病毒载体质粒及神经母细胞瘤细胞株,为进一步探讨Drp1基因在帕金森病(PD)发病过程中的作用提供细胞模型.方法 于Gen Bank中检索人Drp1基因的核苷酸序列,设计并筛选最佳动力学参数的干扰序列及阴性对照序列;根据靶序列分别设计并合成干扰RNA (siRNA)的单链DNA寡核苷酸(DNA oligo),与退火缓冲液反应后形成带黏性末端的双链DNA oligo片段.分别用Age Ⅰ与EcoR Ⅰ双酶切双链DNA oligo片段和GV248慢病毒骨架质粒后,加入T4 DNA连接酶连接,得到重组慢病毒载体质粒Drp1-RNAi和阴性对照质粒.将重组慢病毒载体质粒Drp1-RNAi加入到大肠杆菌TOP10感受态细胞中反应后,分别提取质粒DNA并进行DNA测序.将重组慢病毒载体质粒Drp1-RNAi和阴性对照质粒转染至293T细胞中,培养48 h后收集上清液,离心后过滤得到Drp1-RNAi重组慢病毒和阴性对照慢病毒.将人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y分为Drp1-RNAi重组慢病毒组(D组,用Drp1-RNAi重组慢病毒感染)、阴性对照组(N组,用阴性对照慢病毒感染)、正常对照组(C组,正常培养),采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞Drp1 mRNA,采用Western blotting法检测各组细胞Drp1蛋白.结果 重组慢病毒载体质粒Drp1-RNAi的DNA序列与设计的干扰序列完全一致.D组Drp1mRNA和蛋白的相对表达量为0.47 ±0.12和0.40 ±0.04,N组Drp1 mRNA和蛋白的相对表达量为1.12±0.33和0.67 ±0.05,C组Drp1 mRNA和蛋白的相对表达量为1.02 ±0.23和0.72 ±0.02;D组Drp1 mRNA和蛋白的相对表达量与N组、C组相比,P均＜0.05;N组Drp1 mRNA和蛋白的相对表达量与C组相比,P均＞0.05.结论 成功构建了稳定干扰Drp1基因的慢病毒载体质粒,并建立、筛选出了稳定干扰Drp1基因的神经母细胞瘤细胞株,进一步探讨Drp1基因在PD发病过程中的作用提供细胞模型.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	孙红梅	北京中医药大学中医学院	61	557	13.0	21.0
2	周梦琪	北京中医药大学中医学院	2	0	0.0	0.0
3	柴原	北京中医药大学中医学院	1	0	0.0	0.0
4	冯琬迪	北京中医药大学中医学院	1	0	0.0	0.0
5	马浩洁	北京中医药大学中医学院	2	0	0.0	0.0
6	盖聪	北京中医药大学中医学院	12	53	5.0	6.0