利用CRISPR/Cas9技术构建KMT2D基因敲除的人胚胎干细胞系

• 作者: 吴方 汪捷 郭宁 陈捷凯
• 来源期刊: 生物技术
• 学科: 生物学
• 关键词: CRISPR/Cas9 KMT2D 基因敲除 人胚胎干细胞 歌舞伎综合征
• 年，卷（期）: 2020,（3）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 230-242
• 页数: 13页
• 分类号: Q789
• 语种: 中文
• DOI: 10.16519/j.cnki.1004-311x.2020.03.0038

摘要

[目的]通过CRISPR/Cas9技术构建KMT2D SET结构域双等位基因敲除的人胚胎干细胞HN4细胞系.[方法]通过CRISPR在线设计工具在SET结构域两侧各设计多条sgRNA,利用T7EI选出效率最高的sgRNA,构建到pX330载体中,特异性扩增同源臂,分别构建到双抗性载体中作为Donor.将sgRNA与Donor共同电转至HN4细胞中,经过Puro和Hygo抗性筛选后,挑取单克隆,利用PCR,测序以及q-PCR鉴定等方法鉴定细胞的基因型.[结果]成功构建了靶向KMT2D SET Domain两端的sgRNA的表达质粒,并选择出切割效率最高的sgRNA.PCR鉴定结果显示,有8株细胞可同时扩增出Puro和Hygro两个目的片段,且无野生型条带.通过测序和序列比对确认KMT2D SET已被敲除,双等位基因分别被Puro和Hygro替换.q-PCR结果显示,mRNA层面上,SET Domain已经不表达,而其他位点则不受影响.[结论]成功构建pX330-sgRNA质粒,并验证其具有活性.成功构建了靶向KMT2D SET Domain的分别含有Puro和Hygo不同抗性的Donor.成功建立了稳定的KMT2D基因敲除的人胚胎干细胞系.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	郭宁	中国科学院广州生物医药与健康研究院	3	6	2.0	2.0
2	吴方	中国科学院广州生物医药与健康研究院	2	3	1.0	1.0
3	陈捷凯	中国科学院广州生物医药与健康研究院	3	0	0.0	0.0
4	汪捷	中国科学院广州生物医药与健康研究院	1	0	0.0	0.0