CD137L融合蛋白真核表达载体的构建与表达

• 作者: 徐胜 王淑珍
• 来源期刊: 药物生物技术
• 关键词: CD137L 融合蛋白 真核表达 瞬时转染 HEK293F 蛋白纯化 信号肽
• 年，卷（期）: 2021,（3）
• 所属期刊栏目: 研究论文
• 页码范围: 233-238
• 页数: 6页
• 分类号: Q789
• 语种: 中文
• DOI: 10.19526/j.cnki.1005-8915.20210303

摘要

真核表达系统因具有完整的翻译后修饰、表达蛋白免疫原性较小而成为制药行业生产蛋白药物的新方向.该研究目的是构建CD137L融合基因真核表达载体,瞬时转染HEK293F细胞实现高效表达并进行蛋白纯化与活性分析.以该实验室保存的含有CD137L融合基因的质粒pET11a-FP为模板,采用PCR技术在目的基因N端添加长腹水蚤荧光素酶信号肽和Kozak基因序列、C端添加6 x His纯化标签,使用XbaⅠ、EcoR Ⅰ限制性内切酶酶切并插入pcDNA3.1(+)载体,并对其进行双酶切和测序鉴定,通过转染试剂PEI将构建成功的pcDNA3.1-FP真核表达质粒瞬时转染进入HEK293F细胞,对转染复合物比例及表达时间等参数进行优化.SDS-PAGE电泳和Western印迹检测结果表明每毫升细胞转染1.5 μg质粒和7.5 μg转染试剂、表达4 d时融合蛋白表达水平最高.镍柱亲和纯化结果显示,每升培养基上清可以纯化获得1 mg目的蛋白,功能活性分析表明CD137L融合蛋白能够有效激活人PBMC细胞增殖和抑制人HUVEC细胞的生长.综上所述,该研究成功构建了 CD137L融合基因的真核表达载体并在HEK293F细胞中实现了分泌表达,为该融合蛋白的进一步稳定表达、大规模放大和成药性研究奠定了基础.