摘要:

柚皮苷是影响柚子汁品味的最主要因素,柚苷酶具有将柚皮苷分解为普鲁宁、鼠李糖、葡萄糖和柚皮素等物质的功能,并且这些物质已广泛用于制药和饮料行业.本文介绍了近年来国内外微生物来源的柚苷酶的研究、酶学特性、酶活测定、结构与功能等,表明细菌来源的柚苷酶最适温度为37~70℃,最始pH值为4.5~8.0;真菌来源的柚苷酶最适温度为30~75℃,最始pH值为4.0~11.0.介绍了柚苷酶及其相关产物在食品、饮料和制药工业中的应用进展,发现柚苷酶不仅具有脱苦的作用,还对人类的身体健康具有重要作用.展望了今后的研究方向,应该从柚苷酶高产菌株的选育、发酵产酶的工艺优化和酶的应用等方面开展工作,大幅度提高柚苷酶的产酶水平.

摘要:

[目的]研究碳源对黑曲霉JMU-TS528发酵α-L-鼠李糖苷酶的影响,并探讨葡萄糖阻遏黑曲霉合成α-L-鼠李糖苷酶的分子机制.[方法]分别用5种单一碳源进行摇瓶发酵,高效液相色谱法测定经黑曲霉发酵后产物中的α-L-鼠李糖苷酶活性;通过在培养基中添加葡萄糖进行液态发酵,研究葡萄糖对黑曲霉JMU-TS528产a-L-鼠李糖苷酶的影响,并用实时定量PCR技术检测a-L-鼠李糖苷酶基因rha和葡萄糖抑制基因CreA的相对表达量.[结果]黑曲霉JMU-TS528在以柚皮苷、橘皮苷、芸香苷和鼠李糖为唯一碳源时可分泌α-L-鼠李糖苷酶,以葡萄糖为唯一碳源时不能合成α-L-鼠李糖苷酶;培养基中添加葡萄糖后,黑曲霉发酵产物中α-L-鼠李糖苷酶活性降低,黑曲霉a-L-鼠李糖苷酶基因rha表达量降低,而葡萄糖抑制基因CreA表达量上升.[结论]黑曲霉JMU-TS528菌株液态发酵条件下合成α-L-鼠李糖苷酶需要诱导物作为碳源,该菌株合成α-L-鼠李糖苷酶的能力受到葡萄糖的调节作用,此调控过程可能通过一个依赖阻遏蛋白CreA的机制实现.

摘要:

为了提高α-L-鼠李糖苷酶的发酵产量,利用高效液相色谱法检测α-L-鼠李糖苷酶活力,考察外加碳源葡萄糖、氮源及生长因子对棘孢曲霉JMUdb058固态发酵产α-L-鼠李糖苷酶的调控机制,并以之为依据优化培养基.研究结果表明,葡萄糖和淀粉对α-L-鼠李糖苷酶的产生具有代谢调节作用;外加氮源能大幅度提高α-L-鼠李糖苷酶的活力;相比用硫酸铵为氮源,用豆饼粉为氮源时,由于其中含有淀粉而导致酶合成量降低;磷酸氢二铵比其他铵盐和硝酸盐更能促进α-L-鼠李糖苷酶的合成.添加富含氨基酸的生长因子有利于α-L-鼠李糖苷酶的合成.棘孢曲霉JMUdb058发酵产α-L-鼠李糖苷酶优化后的培养基是:柚皮5 g,磷酸氢二铵0.5 g,酵母浸膏0.075 g,水5 mL,此时α-L-鼠李糖苷酶活力达到10.60 IU/gds,比初始培养基的酶活力提高了84.67％,比其他文献报道的最高酶产量提高了1.5倍.优化后的培养基大幅度提高了棘孢曲霉固态发酵α-L-鼠李糖苷酶的活力,为该酶的发酵生产及开发利用提供了技术参考.

摘要:

[目的]克隆、表达克雷伯氏菌Klebsiella sp.GXK-1 菌株中的α-L-鼠李糖苷酶基因,并研究重组酶的酶学性质.[方法]比对分析 GenBank数据库中克雷伯氏菌同属的α-L-鼠李糖苷酶基因序列,设计简并引物 PCR扩增基因的保守区.扩增目的基因,以 pSE380 为表达载体构建重组质粒 pSE-rha1,并在大肠杆菌E.coli XL-blue进行诱导表达,使用镍亲和层析纯化重组蛋白,研究目的蛋白 RHA1 的酶学性质.[结果]以pNPR 为底物,进行重组酶酶学性质的研究.重组酶 RHA1 的最适 pH 值和最适温度分别为 5.0 和 45℃,Km值为(0.223± 0.030)mmol/L,Vmax值为(1.272±0.121)μmol/(min·mg).在 pH 值为 6～10 的缓冲液内酶活力仍保持在80％以上;在温度为40℃以下时,酶活较为稳定,但在温度高于40℃时酶活力迅速下降.RHA1 能水解pNPR、橙皮苷和芦丁.[结论]RHA1 具有良好的 pH 稳定性,不仅能够水解人工底物pNPR,还能够水解α-1,6 键的天然底物橙皮苷和芦丁,具有一定的医疗应用价值.

摘要:

从解肝磷脂土地杆菌(Pedobacter heparinus)基因组DNA扩增获得两个α-L-鼠李糖苷酶基因PhRha78E和PhRha78G,构建于表达载体pET-28a;将重组表达质粒转入大肠杆菌BL21 (DE3)进行异源表达,PhRha78E和PhRha78G以不溶性包涵体形式大量表达于沉淀中,每克菌体可分别获得0.42 g和0.39 g含目的酶包涵体的沉淀.酶活实验显示二者的不溶性包涵体具有催化活性,可以催化水解底物对硝基苯酚-α-L-吡喃鼠李糖苷(p-nitrophenol-α-L-rhamnopyranoside,PNPR),表明二者在大肠杆菌中以催化活性包涵体形式异源表达.PhRha78E和PhRha78G的最适反应pH值相近,分别为6.5和7.0,PhRha78E在酸性pH 4.8仍能保持62％酶活力,而PhRha78G在碱性pH 8.6依然保持72％酶活力;PhRha78E和PhRha78G的最适反应温度却相差很大,分别为60℃和40℃,PhRha78E在高温70℃条件下仍能保持69％酶活力,而PhRha78G在低温20℃条件下仍有43％酶活力;动力学常数kcat分别为0.18s-1和0.12s-1,Km分别为0.55 mmol/L和0.40 mmol/L.本研究揭示新型α-L-鼠李糖苷酶PhRha78E和PhRha78G在大肠杆菌中以催化活性包涵体形式异源表达,蛋白表达量大,二者酶学性质差异较大,可应用于不同的生物催化领域,并丰富了现有α-L-鼠李糖苷酶资源库.

摘要:

柚苷酶体系由α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶组成,不同来源的柚苷酶性质不同,现在柑橘加工的主要产品柑橘汁的主要面临问题是蜜柚中的苦味物质,柚苷酶可以水解柚皮苷使果汁苦味减轻,是果汁脱苦的关键酶,但是目前国内关于柚苷酶方面的研究报道甚少,而且我国缺乏适合工业化生产的高产酶菌株,这就极大限制了应用,本文主要介绍柚苷酶的酶学性质、微生物生产方法以及在食品工业中的应用.

摘要:

克隆表达乳酸片球菌AS1.2696菌株中的α-L-鼠李糖苷酶基因,研究重组酶的酶学性质.分析乳酸片球菌AS 1.2696菌株的全基因组序列,聚合酶链式反应扩增目的基因,以pSE380为表达载体构建重组质粒pSE-prhα2和pSE-prhα3,在大肠杆菌Escherichia coli XL-blue进行表达,使用镍亲和层析纯化重组蛋白,研究重组酶PRHA2、PRHA3的酶学性质.结果 表明,重组酶PRHA2的最适pH值和温度分别为5.0和60℃,K值为(3.039±0.581) mmol/L,Vmax值为(2.032±0.186) μmol/ (min·mg);PRHA3的最适pH值和温度分别为5.5和45℃,Km值为(2.797±0.132) mmol/L,Vmax值为(113.35±1.485) μmol/ (min·mg).PRHA2和PRHA3能够水解人工底物对硝基苯基-α-L-吡喃鼠李糖苷(p-nitrophenyl-α-L-rhamnopyranoside,pNPR)以及α-1,6键的橙皮苷、芦丁;PRHA2对4-硝基苯基-β-D-阿拉伯糖苷(4-nitrophenyl-β-L-arabinoside,pNPA)有一定的水解活性;PRHA3对淫羊藿苷、淫羊藿次苷I、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C这几种物质C-7位的葡萄糖糖苷键有较弱的水解作用.此外,PRHA3能够水解朝藿定C的C-3位以α-Rha(2→1)α-Rha连接的外侧的鼠李糖苷键,在食品及医疗方面具有一定的应用价值.

摘要:

为了提高α-L-鼠李糖苷酶的热稳定性,对实验室前期构建的K406R、K440R、K573V、E631F四个不同氨基酸位点的单点突变体进行联合突变,得到了K406R-K573V、K406R-E631F、K440R-K573V、K440R-E631F四个联合突变体.结果表明,相比于野生型(wild type,WT),联合突变体K440R-K573V和K440R-E631F的热稳定性有所提高,在60℃时半衰期分别提高了1.13倍,1.44倍;在65℃的半衰期分别提高了1.64倍,1.64倍;在70℃的半衰期分别提高了1.88倍,1.68倍.对突变体K440R-E631F进行圆二色谱分析、分子动力学以及分析微观结构变化分析可知,K440R-E631F突变体与WT相比,内部疏水性有所提高,二级结构中α-螺旋、β-转角、无规则卷曲含量增多,可能与热稳定性的提高相关.

摘要:

α-L-鼠李糖苷酶是一种在食品、药品中有重要用途的糖苷酶,但其结构与功能关系尚不明确,限制了优良酶制剂的设计.本文通过硫酸铵分级沉淀、疏水层析和亲和层析从塔宾曲霉固态发酵柚皮产物中分离纯化得到了一种α-L-鼠李糖苷酶,纯化倍数和比活力分别为34和21105 IU/mg,SDS-PAGE测得该酶的分子质量为120 ku;纯化得到的α-L-鼠李糖苷酶最适反应pH为4.0,最适反应温度为50℃,pH稳定性和热稳定性好;Fe2+对酶活有促进作用,Mn2+、Ca2+、Cd2+对酶有抑制作用;该酶可水解柚皮苷,但对芸香苷和对硝基苯酚鼠李糖的转化率较低,不水解杨梅苷和柴胡皂苷C.以上结果表明纯化得到的α-L-鼠李糖苷酶在金属离子影响特性、底物特异性方面具有新颖性,丰富了α-L-鼠李糖苷酶的结构与功能关系研究素材.

摘要:

α-L-鼠李糖苷酶广泛应用于食品加工、医药及医药前体的制备.研究从海洋样品中筛选产α-L-鼠李糖苷酶的细菌,对菌株进行鉴定,并对α-L-鼠李糖苷酶粗酶性质进行测定.通过透明圈平板筛选法从海州湾海域海泥样品中筛选获得一株产α-L-鼠李糖苷酶的细菌菌株DTC03.通过形态学特征、生理生化特性,以及16SrDNA序列的扩增与分析,将菌株DTC03鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis).对菌株DTC03α-L-鼠李糖苷酶粗酶液酶学性质进行测定,该酶最适催化温度和pH分别为40℃和pH7.0;在50℃范围内保持1h后,剩余酶活力高于50％;在pH6.0 ～ 8.0的缓冲液放置12h后,仍有60％以上酶活.金属离子Ba2+和Al3+对酶有显著激活作用,而Ni2+、Cu2+和Cd2+对酶有显著抑制作用.目前尚未见Bacillus velezensis产α-L-鼠李糖苷酶的报道,研究结果为该酶的进一步研究奠定实验基础.