扩展青霉碱性脂肪酶cDNA的克隆和表达

• 作者: 孙崇荣 李江华 邬敏辰 黄伟达
• 来源期刊: 复旦学报(自然科学版)
• 学科: 生物学
• 关键词: 扩展青霉WMC20718 碱性脂肪酶 克隆 表达
• 年，卷（期）: 2001,（5）
• 页码范围: 509-515
• 页数: 7页
• 分类号: Q556
• 字数: 5311字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.0427-7104.2001.05.009

摘要

采用TRIzol试剂一步法所抽提的总RNA的D(260)/D(280)值为1.82,甲醛变性电泳呈现真核微生物所特有的28S rRNA和18S rRNA条带. 根据扩展青霉所产碱性脂肪酶(Lip PE)N末端2 0个氨基酸残基序列和真核生物mRNA3′端具有poly(A)等所提供的生物信息,采用RT-PCR技术和3′-RACE法扩增了Lip PE成熟肽编码区和3′非编码区的cDNA,直接将该PCR产物克隆至pUCm-T载体中. 序列分析表明,该碱性脂肪酶含有258个氨基酸,其中保守的五肽序列为 Gl y-His-Ser-Leu-Gly. 进一步采用ClonTech公司的SMARTTM PCR cDNA文库构建试剂盒,扩增、克隆和测定了自转录起始点至编码区的cDNA片段,从而完成了Lip EP完整cDNA 的分析测定. 最后将编码完整脂肪酶蛋白的cDNA克隆至pGEX-5X-3表达载体中,在大肠杆菌BL21中进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测结果表明,所表达的GST-Lip EP融合蛋白分子质量约为53 ku;免疫印迹(Western Blotting)技术证明了所克隆的cDNA确为编码扩展青霉W MC20718脂肪酶的基因.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	邬敏辰	复旦大学生命科学学院	163	1504	22.0	29.0
5	黄伟达	复旦大学生命科学学院	57	398	13.0	15.0
6	李江华	江南大学医学系	78	362	10.0	15.0
7	孙崇荣	复旦大学生命科学学院	16	180	8.0	13.0