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摘要:
目的:利用中间载体pGEM-T easy vector 构建表达型载体pET15b-EGFP ,在大肠杆菌中高效表达可溶性蛋白EGFP并将其纯化.方法:以质粒pLEGFP-C1为模板采用聚合酶链反应(PCR)的方法特异性扩增EGFP cDNA序列,利用Taq DNA聚合酶的非模板依赖性末端转移酶活性催化PCR扩增的EGFP序列和三磷酸脱氧腺苷(dATP)反应,在EGFP序列两3'端加"A",将纯化后的EGFP序列与中间载体pGEM-T easy vector连接后转化感受态大肠杆菌DH5α,经蓝白筛选,挑取白色单菌落进行扩增﹑酶切鉴定,正确重组的质粒命名为pGEM-T-EGFP.用XhoI和BamHI分别双酶切pGEM-T-EGFP和pET15b,低熔点琼脂糖回收EGFP cDNA和线性化的pET15b片段后将两片段相连,转化感受态大肠杆菌DH5α并对重组质粒进行酶切鉴定和DNA测序,获取正确重组的表达型质粒并命名为pET15b-EGFP.将正确重组的质粒pET15b-EGFP转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),用异丙基β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达.利用表达蛋白N端的组氨酸"标签"(His-tag)进行Ni2+-树脂柱亲和层析纯化,SDS-PAGE和Western blotting鉴定纯化蛋白质. 结果:经测序证实重组质粒pET15b-EGFP中的EGFP cDNA序列与从Clontech公司购买的质粒pLEGFP-C1中的EGFP cDNA序列完全一致,从而成功构建了表达型重组质粒pET15b-EGFP.pET15b-EGFP转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)并经诱导后得到高效表达,表达量可达66 mg/100 ml菌液,SDS-PAGE和Western blotting显示纯化蛋白为目的蛋白EGFP.结论:表达型重组质粒pET15b-EGFP的成功构建和表达、纯化为细胞穿透肽-EGFP融合蛋白穿透细胞能力的研究奠定了基础.
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内容分析
关键词云
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文献信息
篇名 pET15b-EGFP原核表达载体的构建及其表达和纯化
来源期刊 郧阳医学院学报 学科 生物学
关键词 TA克隆载体 增强型绿色荧光蛋白(EGFP) 重组质粒 蛋白表达 蛋白纯化
年,卷(期) 2005,(6) 所属期刊栏目 论著
研究方向 页码范围 321-325,封2,封3
页数 7页 分类号 Q782
字数 4323字 语种 中文
DOI 10.3969/j.issn.1006-9674.2005.06.001
五维指标
作者信息
序号 姓名 单位 发文数 被引次数 H指数 G指数
1 郭凌郧 郧阳医学院附属人民医院临床医学研究所 26 189 9.0 12.0
2 王家宁 郧阳医学院附属人民医院临床医学研究所 119 709 13.0 20.0
3 董晓 郧阳医学院附属人民医院临床医学研究所 7 57 4.0 7.0
7 黄永章 郧阳医学院附属人民医院临床医学研究所 66 379 11.0 16.0
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研究主题发展历程
节点文献
TA克隆载体
增强型绿色荧光蛋白(EGFP)
重组质粒
蛋白表达
蛋白纯化
研究起点
研究来源
研究分支
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引文网络交叉学科
相关学者/机构
期刊影响力
湖北医药学院学报
双月刊
1006-9674
42-1815/R
大16开
湖北省十堰市人民南路30号
1982
chi
出版文献量(篇)
4066
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9322
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